肝癌患者血清microRNA-21水平变化*

郝清亚，王以浪，姚登福，缪亚军，印 滇

·肝癌·

肝癌患者血清microRNA-21水平变化*

郝清亚，王以浪，姚登福，缪亚军，印 滇

目的分析不同肝病患者血清microRNA-21（miR-21）水平，以探讨miR-21对肝细胞癌（HCC）的诊断价值。方法以实时定量逆转录PCR法检测正常人、慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化和HCC患者（各组均为25例）血清miR-21水平，分析miR-21水平与HCC临床病理学特征的关系。结果正常人、CHB和肝硬化患者血清miR-21相对水平分别为（1.1±1.7）、（2.3±2.6）和（2.8±2.5），而HCC患者为（22.6±4.4），显著高于前三组（P＜0.001）；HCC患者术后1w和1m血清miR-21相对水平分别为（18.4±3.5）和（3.1±2.7），均较术前显著降低（P＜0.001）；HCC患者血清miR-21水平与肿瘤大小、癌栓以及HBV感染相关，与肿瘤分化程度、数目和血清AFP水平无相关性。结论miR-21在HCC患者血清中显著升高，可能作为HCC早期诊断的潜在标志。

肝细胞癌；miRNA-21；血清；诊断

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的死亡率在全球恶性肿瘤中排在第三位，在我国排在第二位。AFP仍然是目前临床应用最广泛的HCC标记物，但其阳性率仅为70%左右[1]，寻找特异性生物标记物是HCC早期诊断的研究热点[2]。微小RNA（microRNA， miRNA）是一类非编码单链小RNA分子，由22个核苷酸（nucleotide，NT）组成，以互补配对方式与靶基因碱基结合，通过多种途径抑制mRNA的翻译，发挥类似癌基因和抑癌基因的作用。研究表明，多种miRNA参与肝癌的发生和发展[3，4]。microRNA-21（miR-21）通过调节其靶基因，参与HCC的发生、复发、转移和耐药等。miRNA在外周血中可稳定存在[5]。本文以荧光定量逆转录PCR法检测了HCC、乙型肝炎、肝硬化患者和正常人外周血miR-21水平，分析其在手术前后的变化及其与肿瘤大小、分化程度、转移等病理学特征的关系，以探讨其在HCC诊断中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 病例来源收集2010年1月～2012年1月我科诊治的HCC患者25例，男性19例，女性6例；年龄在35～68岁，平均年龄（50.8±7.8）岁。经术后组织病理学检查证实诊断，并符合2009年发布的《原发性肝癌规范化诊治专家共识》[6]。纳入标准：术前未接受过放、化疗及介入治疗。另选择健康体检者、慢性乙型肝炎和肝硬化患者各25例。CHB和肝硬化诊断符合2010年中华医学会修订的《慢性乙型肝炎防治指南》[7]。纳入标准：血清ALT水平升高（≥2ULN），HBV DNA≥1×105拷贝/毫升。排除标准：合并感染甲、丙、丁、戊型肝炎，脂肪肝、酒精性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝病。在HCC患者中，肿块直径≥5 cm 16例，＜5 cm 9例，其中＜3 cm 5例；高分化、中分化和低分化分别为6例、7例和12例。伴有癌栓8例，无癌栓17例。AFP＞400 μg/L10例，≤400 μg/L 15例。HBsAg阳性21例，阴性4例。

1.2 血清miR-21定量检测抽取静脉血5ml，加入含有EDTA试管中。2h后1600 g离心10 min，将上清液转移到新的EP试管中，再16000 g离心10 min，抽提总RNA（美国Molecular Research Cente公司）。合成第一链cDNA（以色列Fermentas公司）。检测miR-21和miR-16 qRT-PCR引物由上海英骏生物公司合成（表1）。采用EzOmicsTM一步实时荧光定量PCR法检测血清miRNA（百奥迈科生物技术有限公司）。将miRNA反转录反应和qPCR定量反应放在一个试管中进行。每个样本取50 ng RNA，qPCR混合物12.5μL，miRNA-21反转录引物（10μmol/L）0.5μL。取miRNA-21正、反向引物各0.5μL（10μmol/L），加入RNA酶抑制剂，再加ddH2O至25μL，进行扩增。miR-21表达量的计算以miR-16为内参，采用实时定量PCR的Ct（cycle threshold）均值来表示，相对定量采用2－ΔΔCt来计算[8]。该方法是目的基因与内参基因的Ct值比较后（ΔCt），再将不同肝病组与正常组比较（ΔΔCt）。ΔCt＝（Ct miR-21－Ct miR－16），ΔΔCt＝［（Ct miR-21－Ct miR－16）不同肝病患者－（Ct miR-21-Ct miR－16）正常人］，2－ΔΔCt的数值反映血清miR-21相对于正常人血清水平的倍数（定量PCR扩增仪、凝胶成像分析仪和核酸蛋白分析仪购自美国BIO-RAD公司）

表1 检测miR-21的引物序列

1.3 血清AFP定量检测采用ELISA法（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.4 统计学处理应用SPSS17.0统计软件，所有数据以（±s）表示。多个样本均数间的比较先进行方差齐性检验，方差齐性时进行单因素方差分析，两样本均数行t检验。采用双变量线性回归分析相关性。以P＜0. 05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人群血清miR-21水平比较见表2。HCC患者血清miR-21水平显著高于正常人、CHB和肝硬化患者（P＜0.05），HCC患者术后1w血清miR-21水平较术前降低（P=0.0005），术后1m miR-21水平接近正常人水平（P＞0.05）。

表2 各组人群血清miR-21水平（±s）比较

表2 各组人群血清miR-21水平（±s）比较

与正常人比，①P＜0.001；与HCC比，②P＜0.001

2.2 影响肝癌患者血清miR-21水平的因素分析见表3。分析发现肝癌患者血清miRNA-21与AFP水平显著相关（Pearson相关系数=0.0869，P=0.6794）。

表3 影响HCC患者血清miR-21水平（±s）的因素分析

表3 影响HCC患者血清miR-21水平（±s）的因素分析

①P=0.001；②P=0.002；③P=0.017

3 讨论

miRNA与靶基因mRNA 3'非编码区的碱基互补配对结合，通过多种方式抑制mRNA的翻译，从而抑制靶基因的表达。其主要作用方式有：（1）抑制mRNA起始翻译；（2）促使多聚核糖体脱落，抑制蛋白翻译延伸；（3）募集蛋白酶降解翻译中的蛋白；（4）促进mRNA降解。miRNA通过调节靶RNA表达而发挥广泛的生理和病理作用。根据miRNA功能不同，可以将其分为癌基因和抑癌基因两类。miRNA表达异常会严重影响细胞信号转导途径的功效，导致细胞增殖和分化失去控制，最终导致肿瘤的发生[9，10]。研究表明miR-21在HCC、肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中过表达，其在HCC组织中的水平是癌旁组织的近3倍，与HCC患者术后预后密切相关（HR=1.6847）[11，12]。miR-21靶基因包括数种抑癌基因，如p53、PTEN/AKT信号通路、RAS信号通路、FasL和TPM1等，miR-21可抑制靶基因表达，参与肿瘤细胞增殖、细胞周期调控、凋亡和侵袭转移，起着癌基因的作用。

miR-21序列的增强子区域存在核转录因子-κB（NF-κB）亚单位p65绑定序列，miR-21是NF-κB的下游靶基因[13]。NF-κB为具生物活性的转录因子，调控多种信号途径。前期研究显示HCC组织NF-κB过表达；在大鼠HCC模型发现NF-κB表达随HCC形成逐渐升高，用NF-κB抑制剂沙利度胺喂饲HCC模型大鼠后可减少或延缓HCC形成。小干扰RNA抑制NF-κB活化，可显著促进HepG2细胞凋亡[14]。作为NF-κB靶基因的miR-21，在NF-κB异常活化介导下表达上调可能在HBV相关HCC的形成和进展中扮演重要角色。

HBsAg阳性HCC患者血miR-21水平高于HB-sAg阴性患者，与HBV感染相关。我国HCC患者80%左右伴HBV感染或肝炎肝硬化背景，HBx蛋白在诱导HCC形成中扮演重要角色[15，16]。程序性细胞死亡因子4（PDCD4）通过诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长。PDCD4 mRNA 3'非编码区与miR-21部分序列碱基互补，是miR-21的靶基因，miR-21可下调PDCD4表达，HBx通过上调miR-21抑制PDCD4表达，促进HCC形成。肿瘤越大，其血清miRNA-21水平越高。细胞内成熟的miRNA被脂蛋白或脂质包被成外切酶体，主动分泌至胞外进入外周血液循环。当HCC组织增大，HCC细胞数目增多，其释放到外周血的miR-21量也增多。较大HCC病灶易出现因病灶生长过快致癌组织缺氧导致坏死和凋亡，细胞破坏，胞内物质释放到外周血中增多；伴脉管癌栓患者血清miR-21水平较无脉管癌栓者高，癌栓主体为癌细胞，提示肿瘤细胞脱落原发灶入血液循环，其释放miR-21直接到外周血，致血miR-21水平升高。

miRNA在外周血中可以稳定存在，耐RNA酶降解。本文显示HCC患者术后一周其血清miR-21水平较术前无明显降低，表明miR-21在血清中半衰期较长。术后一月其水平较术前有明显降低，提示术后检测患者血清miR-21来推测患者复发或转移的时间窗应该在一月或更晚之后。

[1]Baig JA，Alam JM，Mahmood SR，et al.Hepatocellular carcinoma（HCC）anddiagnosticsignificanceofalpha-fetoprotein（AFP）.J Ayub Med Coll Abbottabad，2009，21（1）：72-75.

[2]MarquardtJU，GallePR，TeufelA.Moleculardiagnosisand therapy of hepatocellular carcinoma（HCC）：an emerging field for advanced technologies.J Hepatol，2012，56（1）：267-275.

[3]Braconi C，Henry JC，Kogure T，et al.The role of microRNAs in human liver cancers.Semin Oncol，2011，38（6）：752-763.

[4]Law PT，Wong N.Emerging roles of microRNA in the intracellular signaling networks of hepatocellular carcinoma.J Gastroenterol Hepatol，2011，26（3）：437-449.

[5]Zhu Q，Wang Z，Hu Y，et al.miR-21 promotes migration and invasion by the miR-21-PDCD4-AP-1 feedback loop in human hepatocellular carcinoma.Oncol Rep，2012，27（5）：1660-1668.

[6]中华医学会肝病学分会和感染病学会.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.实用肝脏病杂志，2011，14（2）：81-90.

[7]中国抗癌协会肝癌专业委员会、中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会和中华医学会肝病学分会.原发性肝癌规范化诊治的专家共识.实用肝脏病杂志，2009，12（5）：321-328.

[8]Livak KJ，Schmittgen TD．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）.Methods，2001，25（4）：402－408.

[9]Wang L，Tang H，Thayanithy V，et al.Gene networks and microRNAs implicated in aggressive prostate cancer.Cancer Res，2009，69（24）：9490-9497.

[10]Gabriely G，Wurdinger T，Kesari S，et al.MicroRNA 21 promotesgliomainvasionbytargetingmatrixmetalloproteinase regulators.Mol Cell Biol，2008，28（17）：5369-5380.

[11]Schetter AJ，Leung SY，Sohn JJ，et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma.JAMA，2008，299（4）：425-436.

[12]Vinciguerra M，Sgroi A，Veyrat-Durebex C，et al.Unsaturated fatty acids inhibit the expression of tumor suppressor phosphatase and tensin homolog（PTEN）via microRNA-21 upregulation in hepatocytes.Hepatology，2009，49（4）：1176-1184.

[13]Zhou R，Hu G，Gong AY，et al.Binding of NFkappaB p65 subunit to the promoter elements is involved in LPS-induced transactivation of miRNA genes in human biliary epithelial cells.Nucleic Acids Res，2010，38（10）：3222-3232.

[14]王以浪，姚登福，吴玮，等.小干扰RNA抑制核因子-κB活化对HepG2细胞凋亡的影响.中华肝脏病杂志，2010，18（8）：609-613.

[15]Knoll S，Fürst K，Thomas S，et al.Dissection of cell contextdependent interactions between HBx and p53 family members in regulation of apoptosis：a role for HBV-induced HCC.Cell Cycle，2011，10（20）：3554-3565.

[16]Kew MC.Hepatitis B virus x protein in the pathogenesis of hepatitis B virus-induced hepatocellular carcinoma.J Gastroenterol Hepatol，2011，26（1）：144-152.

（收稿：2013-07-11）

（校对：陈从新）

Serumlevel of microRNA-21 in patients with hepatocellular carcinoma

Hao Qingya，Wang Yilang，Yao Dengfu，et al.
First People’s Hospital，Natong 226001，Jiangsu Province，China

ObjectiveTo evaluate serum level of microRNA-21（miR-21）in normal persons and patients with different liver diseases，and to investigate its effect in the diagnosis of hepatocellular carcinoma（HCC）. MethodsThe serum level of miR-21 in healthy controls（n=25），patients with chronic hepatitis B（CHB，n=25），cirrhosis（n=25），and HCC（n=25）were measured by real-time quantitative RT-PCR.The relationships between serum miR-21 levels and clinical pathological features of HCC were also investigated.ResultsThe relative serum levels of miR-21 in normal controls，CHB and cirrhotic patients were（1.1±1.7），（2.3±2.6）and（2.8±2.5），respectively，all of which were significantly lower than that in HCC patients（22.6±4.4），P＜0.001；The relative serum levels of miR-21 in HCC patients one week and one month after surgery were（18.4±3.5）and（3.1±2.7），respectively，significantly lower than that before operation（22.6±4.4），P＜0.001；Serum levels of miR-21 were correlated with tumor size，tumor thrombosis and HBV infection，but not with tumor numbers，tumor differentiation and serum AFP levels. ConclusionsSerum levels of miR-21 is elevated in HCC patients and might be used as a potential biomarker for the early diagnosis of HCC.

Hepatocellular carcinoma；MicroRNA-21；Serum；Diagnosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.020

国家国际科技合作专项（2013DFA32150）；南通市科技计划项目（S11904/K2010026）

226001江苏省南通市第一人民医院肝胆外科（郝清亚）；肿瘤科（王以浪，缪亚军，印滇）；南通大学附属医院临床医学研究中心（姚登福）

郝清亚，男，31岁，医学硕士，住院医师。主要从事肝癌的分子诊断学研究。E-mail：895325173@qq.com

王以浪，E-mail：oncowang@163.com