非梗阻性不育患者精子膜超微结构研究

王 然，殷会莹，郭明申，刘淑卓，葛少钦

（1. 河北大学基础医学院，河北 保定 071000；2. 河北大学生命科学学院，河北 保定 071000; 3. 河北大学附属医院，河北保定 071000）

非梗阻性不育患者精子膜超微结构研究

王 然1，殷会莹1，郭明申2，刘淑卓3，葛少钦1

（1. 河北大学基础医学院，河北 保定 071000；2. 河北大学生命科学学院，河北 保定 071000; 3. 河北大学附属医院，河北保定 071000）

目的 研究非梗阻性不育患者精子膜超微结构的改变，探讨非梗阻性不育患者精子膜超微结构缺陷对男性不育的影响。方法 利用透射电镜对临床非梗阻性不育患者新鲜精液标本中精子膜的超微结构进行观察。结果 在电镜下，发现该不育男性患者精子多存在质膜、顶体外膜和/或顶体内膜等畸变，膜结构呈多形态超微结构异常的现象，此外，精子核、颈部和线粒体、微管等超微结构也存在病理性改变。结论 精子膜超微结构畸变是非梗阻性男性不育原因之一。

非梗阻性不育；精子膜；超微结构

随着社会不断发展，各种应激因素不断加剧，男性不育作为生殖异常中较容易出现的问题，近年来发病率不断增加。目前，全世界有15%～20%的育龄夫妇存在生育障碍，其中男性原因导致不育的比例占40%～50%[1]。在临床检验中，传统的精液常规分析包括精子计数、活动力和形态学分析是主要的研究方法。但是除无精子症、死精子症或畸精子症等少数严重的男性不育症外，精液常规分析在精确诊断和预测精子的体内外受精能力等方面存在很大的局限性。临床上存在不少不育患者精液常规分析提示正常，但不能使正常育龄女性受孕的情况[2]。

近几年研究发现，不育男性精子不仅存在光镜形态学异常和免疫动力学改变，而且精子的超微结构也发生了病理性改变，精液常规分析不能客观反映精子受精能力。为全面评价精子受精能力，电镜观察精子超微结构亦是必要的[3]，而其中精子膜结构完整性在保证精子质量中的作用不容忽视。

精子膜超微结构的完整性在正常受精过程中起着重要作用[3]。在电镜下观察精子膜超微结构的改变，通过对其结构的变化与男性不育之间的关系进行观察分析，不仅可以为不育症病因学研究增加一项客观的指标，而且还可以更好地预测男性潜在的生育能力，指导临床诊断[4]。同时，前人对男性不育患者精子膜超微结构畸变的报道并不多，为此进行了本实验研究。

1 材料与方法

1.1 受试对象

结婚2年，女方生殖系统功能正常，男方精液常规检查及其它生化指标正常，非梗阻性男性不育患者1例。

1.2 标本采集和处理

禁欲一周后，在室温25～30℃的实验室内，由供精者取精。待精液自动液化后，缓慢注入离心管中，以2 000 r/min离心10 min，用吸管轻轻吸出精浆，沉淀精子用琼脂糖进行预包埋，再用戊二醛固定液固定1 h后，PBS缓冲液（pH=7.2）洗涤3次（10分钟 /次），锇酸固定1 h，然后用Epon812环氧树脂包埋，在光镜下进行半薄定位，用甲苯胺蓝染色，切超薄切片，铅铀双染，透射电镜下观察。

1.3 观察指标

透射电镜下主要观察精子的质膜、顶体内膜、顶体外膜等病理性改变。

2 结 果

通过透射电镜观察，发现该男性不育患者精液精子80%存在精子膜超微结构不同程度的异常，并伴有多种超微结构畸形。本实验着重观察了精子膜超微结构的畸变。

2.1 质膜的异常

在透射电镜下可观察到精子质膜出现了病变。如精子质膜肿胀破损（图1A、1B），质膜边缘与顶体外膜融合变得模糊不清（图1C），多处出现大小不等的囊泡，甚至质膜缺失（图1D）等。

2.2 顶体内外层膜的异常

精子顶体内、外层膜也都出现了病变。在透射电镜下可观察到精子顶体内外层膜破损（图2A、2B），双层膜结构呈不平行或波浪状改变（图2C），部分顶体内外层膜相融合，形成大小不等的囊泡，顶体内容物可呈现低电子密度（图2D、2E），严重者顶体内膜向核内凸出，外膜弯曲外翘，导致顶体与核剥离（图2F），甚者顶体内外层膜缺失，内容物溢出（图2G、2H）等。

图1 精子质膜的异常

3 讨 论

受精是一个极其复杂的生理过程，受多种因素的影响和调控[5]。在此过程中，精子膜结构的完整性与精子新陈代谢、精子获能及顶体反应密切相关，在超微结构水平探讨精子膜结构及功能完整性与男性不育的关系，对临床男性不育症的诊断和治疗具有重要的意义[6]。

精子质膜在受精过程中扮演着非常重要的角色。完整的质膜可以准确地把信息从精子外传到精子内。而且精子在获能过程中，通过其精子质膜上特异性受体与周围环境中的各种因子相互作用，从而能使精子获得受精能力。一般认为精子头的前半部分精子质膜参与顶体反应，顶体后区的精子质膜能识别卵子，并能与卵子的细胞膜相结合。利用透射电镜观察到本例非梗阻性不育患者精子质膜在超微结构水平发生了结构畸变。精子质膜肿胀破损，质膜边缘与顶体外膜融合变得模糊不清（图1A、1B、1C），多处出现大小不等的囊泡，甚至质膜缺失（图1D）等。这些病变不仅会直接影响到细胞的信息传递和物质交换，进而影响精子的活力和新陈代谢，而且还严重破坏了精子膜上特异性受体和精卵识别相关位点，从而使精子获能和顶体反应受限，导致精子无法受精[7]。精子质膜的结构完整性直接反映精子的功能状况，是影响男性不育的重要原因。

精子发生顶体反应是受精的关键[7]，而精子顶体内外膜结构是否完整在精子发生顶体反应过程中起着重要作用[8]。人类精子顶体位于精子前端，覆盖在精子核的前2/3 区，是一个膜结合的精子细胞特有帽状结构[9]。这个特殊的结构可将与细胞膜接触最近的顶体外膜和与精子核接触最近的顶体内膜隔开，当顶体反应发生时，顶体外膜与质膜发生多位点的融合，大量融合孔的形成使顶体结构不稳定，引起顶体内容物即十多种顶体酶释放，这些酶类作用于卵子透明带，协助精子进入卵细胞，从而完成受精[10]。精子顶体内释放的顶体酶种类与数量多少与顶体内外层膜结构完整程度存在密切关系[3]。利用电镜观察到该例非梗阻性不育患者精子顶体内外层膜超微结构都存在不同程度的改变，顶体内外层膜肿胀破损（图2A、2B），可呈不平行或波浪状改变（图2C），部分外膜形成大小不等的囊泡（图2D、2E），顶体与核剥离（图2F），严重者顶体内外层膜破损，内容物溢出（图2G、2H）等。这些病变使得存在于顶体外膜上的诱导顶体反应发生的信号通路阻断，电压依赖性Ca2+通道遭到破坏，导致质膜溶解和顶体反应无法发挥生物学效应[11]，存在于顶体内膜上的顶体酶无法释放[12]，使结合到卵子透明带上的精子不能发生顶体反应，精子因此不能穿透卵子透明带，无法完成受精。Liu等[13]研究也证实了这一点，他研究发现，精子透明带结合率低主要是精子膜缺陷，导致与透明带结合和穿透障碍。

精子获能和顶体反应是精子最终完成受精过程中两个主要的生理活动，对精子受精有着非常重要的意义。但是精子膜的功能障碍及结构损伤，会降低精子获能和精子顶体反应，影响精子的受精能力，导致不育[14]。

精子膜不仅是精子活动和新陈代谢的基础，也是精子获能和精卵融合等受精过程的基础，精子膜超微结构的畸变会使精子膜功能受到影响，其功能的优劣程度又可直接反映精子的功能状态，因此，精子膜结构完整性是受精过程完成必备的条件[15]。在超微结构水平上探讨精子膜结构完整性与男性不育之间的关系，对临床男性不育症的诊断和治疗具有重要的意义。

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（责任编辑：刘俊华）

Study on sperm membrane ultrastructure of non-abstructive infertile male

WANG Ran1, YIN Huiying1, GUO Mingshen2, LIU Shuzhuo3, GE Shaoqin1
(1. College of Basic Medical Sciences of Hebei University, Baoding 071000, China; 2. College of Life Science, Hebei University, Baoding 071000, China; 3. Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, China)

Objective To explore the influence of sperm membrane ultrastructure damage on the non-obstructive infertile male. Methods After embedding the fresh semen from one case of infertile male, using transmission electron microscopy (TEM) to observe the sperm plasma membrane, outer acrosomal membrane , inner acrosomal membrane etc. Results Under the electron microscope, the defects of plasma membrane, outer acrosomal membrane and inner acrosomal membrane in the semen sperm of this infertile man were examined, with some of other abnomal spermultrastructures observed, such as defects in the sperm acrosome, nucleus, neck, mitochondrial and microtubules. Conclusion The non-obstructive male infertility is closely related to the abnormality of sperm membrane ultrastructure.

non-obstructive infertility; sperm membrane; ultrastructure

R69

A

1674-490X(2014)01-0008-05

2013-12-05

河北省自然科学基金项目（H2013201259）；河北省卫生厅医学科学研究计划项目（2009173）；河北省计生委科研计划项目（2009-B16）；河北省教育厅自然科学研究计划项目（2009105）；河北大学医学学科建设项目（2012A1004）；河北大学博士基金项目（2007B06）；河北省2013年留学人员科技活动项目；河北大学创业训练项目（2013088）

王然（1988—），女，河北石家庄人，在读硕士，主要从事男性生殖研究。E-mail: wran2008@qq.com

葛少钦（1967—）， 男，河北保定人，教授，博士后，硕士生导师。 主要从事动物分子与生化及男性生殖研究。E-mail: gesq67@163.com