用SMMC-7721和Hep-G2全二维细胞膜-整体柱色谱联用技术筛选中药鸦胆子的抗癌活性物质

纪松岗，丁璇，曹岩，陈啸飞，贾丹，王冬尧，柴逸峰(.解放军40医院药剂科，山东青岛 6607;.第二军医大学药学院，上海 00433)

·论著·

用SMMC-7721和Hep-G2全二维细胞膜-整体柱色谱联用技术筛选中药鸦胆子的抗癌活性物质

纪松岗1，丁璇2，曹岩2，陈啸飞2，贾丹2，王冬尧2，柴逸峰2(1.解放军401医院药剂科，山东青岛 266071;2.第二军医大学药学院，上海 200433)

目的 筛选中药鸦胆子中的抗癌活性成分。方法同时使用全二维色谱技术和细胞膜色谱技术联用质谱技术。结果经初步分离筛选，得到了腺苷和鸦胆子苦素B两种潜在的抗癌活性成分。结论该方法对中药中活性成分的筛选，具有快速、高效和在线的特色和优点。

细胞膜色谱;全二维色谱;SMMC-7721;Hep-G2;鸦胆子;抗癌

细胞膜色谱作为近几年来新兴的一种活性成分筛选技术，因其在线、高通量、自动化的优点，被越来越多的用于中药活性成分的筛选研究［1］。该技术原理简单，即使用细胞膜与硅胶进行孵育，得细胞膜-硅胶固定相，该固定相具有生物活性，使用该固定相装填色谱柱，得到可以用于常规液相条件下的细胞膜色谱柱，从而实现在线的自动化高通量筛选［2］。中药鸦胆子是苦木科植物鸦胆子Brucea javanica(L)Merr.的干燥成熟果实，近几年来有研究证明从中提取得到的鸦胆子油具有潜在的抗癌活性［3］，我国于1978年开始研制鸦胆子油乳，并用于治疗各种恶性肿瘤，使用该剂型与化疗和放疗联合使用，可以显著改善治疗效果(P＜0.05)［4］，但是其具体活性成分有待进一步验证。因此，细胞膜色谱具有高通量、快速的特点，十分适用于初步筛选鸦胆子中相关的抗癌活性成分。但是细胞膜色谱作为一种生物活性色谱，其效率较低、柱效较差［5］。为克服这些不足，本研究搭建了新型的SMMC-7721细胞-鸦胆子和Hep-G2细胞-鸦胆子的全二维细胞膜色谱-整体柱色谱的高通量活性成分筛选模型，用于筛选鸦胆子油的抗癌活性成分，可以有效提高细胞膜色谱对复杂体系成分的分离效能［6］，使得筛选结果更加稳定可靠。

1 仪器和材料

1.1 仪器Angilent-1200高效液相色谱仪(美国，安捷伦科技有限公司)，Angilent-6200飞行时间质谱仪(美国，安捷伦科技有限公司)，Chromolith RP 18e col-umn整体柱(德国，默克集团有限公司)，RheodynetitanMX型电子控制十通阀(美国，艺达思科技有限公司)，十万分之一电子天平(美国，梅特勒公司)。

1.2 材料SMMC-7721细胞，Hep-G2细胞，硅胶(5 μm，大连美仑公司)，乙腈(色谱纯，默克公司)，甲酸(色谱纯，上海晶纯生化科技股份有限公司)，水由Milli-Q超纯水纯化系统制备，鸦胆子(上海雷允上药房)，石油醚为分析纯，伊马替尼对照品(南京安格医药化工有限公司)，四环素对照品(中国药品生物制品检定所)。

2 方法

2.1 SMMC-7721和Hep-G2细胞膜色谱的制备取一定量的SMMC-7721或Hep-G2细胞(3.5× 107)，经超声破碎后，低速离心10 min，取上清液12 000 g高速离心20 min，得细胞膜沉淀。然后将所得细胞膜沉淀物用5 ml生理盐水复溶，与活化硅胶混合，在真空条件下涡旋反应5 min，之后转入4℃冰箱中孵育12 h，得到细胞膜-硅胶固定相。

将孵育好的细胞膜色谱固定相取出，用PBS离心清洗3次(1 000 r/min，5 min)，再用4 ml PBS复溶，进行细胞膜色谱柱装填操作。将装填好的细胞膜色谱柱用PBS在37℃下，用10 mmol/L醋酸铵溶液，以流速0.2ml/min，平衡1 h即可使用，每次进样量为5μl。

2.2 鸦胆子活性部位的提取用石油醚作为提取溶剂，按照7:1的液料比，在60°C水浴和400W的超声条件下，提取2 h，完成鸦胆子活性部位的提取。

2.3 整体柱条件的探索色谱柱:Chromolith RP 18e column(100 mm×4.6 mm，5μm，德国，默克集团有限公司);流动相:A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈;柱温:26℃;总流速:5.0 ml/min;具体梯度洗脱条件见表1。

图1 全二维整体柱-细胞膜色谱系统

表1 整体柱梯度洗脱条件

2.4 质谱条件飞行时间质谱仪使用电喷雾正离子全扫描模式。扫描范围:110～1 100 m/z;毛细管电压:3 500 V;雾化器压力:30 psi;干燥气流速:10 L/min;干燥气温度:350℃;碎片电压:120 V;分流比1∶10。

2.5 二维色谱模型的搭建全二维细胞膜-整体柱-飞行时间质谱仪系统由三大部件组成。如图1所示，该全二维系统包含一台Agilent1200的高效液相色谱仪，一台Agilent6200系列的飞行时间质谱仪，以及一个可以切换A、B两种连接状态的十通阀。泵3将第一维细胞膜色谱中分离的成分冲入样品储备环中，待进入第二维色谱进行进一步的分离分析。为加快全二维分析速度，十通阀上接有两个500μl的样品储备环，将这两个储备环中的样品，根据第二维色谱的分析分离时间，定为每隔320 s即自动切换A和B状态进样，由泵1和泵2按照梯度洗脱程序冲入整体柱色谱进行第二维的分离，并于飞行时间质谱仪进行分析鉴别。当十通阀状态切换至A时，泵3将5μl鸦胆子提取液冲入细胞膜色谱柱，再富集于定量环1中，经过2.5min富集后，定量环中充满富集的组分，泵3停止工作，切换至B状态;此时泵1和泵2按照梯度洗脱程序，将定量环1中富集的组分冲入整体柱中进行分离，利用TOFMS进行成分分析，而泵3再次开始工作并于2.5min后停止，停止后等待整体柱分析完成后再切换回A状态。利用该切换阀的自动切换功能，使其在A和B状态间如此相互切换，从而实现鸦胆子活性成分在细胞膜色谱柱和整体柱上的在线全二维分析。

3 结果

3.1 全二维细胞膜色谱模型的适用性考察Hep-G2细胞核SMMC-7721细胞作为肝癌细胞系，具有丰富的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)［7，8］。因此，本研究采用具有EGFR拮抗性的伊马替尼作为阳性对照品［6］，采用四环素作为阴性对照品［9］，对搭建的全二维整体柱-细胞膜色谱模型进行了适用性考察，两种对照品的保留情况如图2所示，纵坐标代表一维色谱(整体柱色谱)上的保留时间，横坐标代表二维色谱(细胞膜色谱)上的保留时间，颜色深浅分别代表活性成分的响应值从低到高。其中阴性对照品四环素(1)并无明显保留趋势，而阳性对照品伊马替尼(2)则具有较为明显的保留行为。结果表明，所搭建的全二维色谱具有相应的生物学活性，可以用于药物活性筛选实验。

图2 系统适用性考察

3.2 鸦胆子提取液中活性成分的筛选利用所搭建好的全二维细胞膜色谱模型，对鸦胆子提取液进行了活性成分筛选实验。根据文献，构建了鸦胆子提取液中所含活性成分的化合物库，通过使用提取离子的方法，利用masshunter软件，自动对所得总离子流图进行［M+H］+峰提取，根据文献调研构建的化合物库，对比得到了腺苷(3)和鸦胆子苦素B(4)两种潜在活性物质，其在细胞膜色谱上的保留行为良好，有明显的拖尾行为，具有潜在的生物学活性，如图3所示。

图3 活性成分筛选结果

4 结论

本研究利用细胞膜色谱技术、在线全二维技术和HPLC-TOFMS技术联用，实现了对中药鸦胆子活性成分的在线全二维筛选，筛选和分离结果快速、准确，共鉴定出两个潜在的有效成分，其药理活性和作用还需进一步研究。该方法充分利用了细胞膜色谱的生物学活性、全二维技术的分离效能和质谱技术的鉴定能力，改善了传统细胞膜色谱分离效果差的现状，实现了在线的活性成分筛选和鉴定，操作简便、节省时间、分离效果良好，可以为天然产物活性成分的分离分析提供一个良好的解决途径。

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Screening of potential active anti-cancer com ponents of Brucea javanica by SMMC-7721 and Hep-G2 com prehensive two dimensional CMC-monolith chromatography

JISonggang1，DING Xuan2，CAO Yan2，CHEN Xiaofei2，JIA Dan2，WANG Dongyao2，CHAIYifeng2(1.Department of Pharmacy，No.401 Hospital of PLA，Qingdao 266071，China;2.School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

Objective Toscreen potential active anti-cancer components of Brucea javanica.MethodsThis research has employed comprehensive two dimensional chromatographic technology and cellmembrane chromatographic technology simultaneously with mass spectrometry as detector.ResultsAdenosine and Bruceine B were found to be potentially anti-cancer active.ConclusionThis study has combined the advantages of online，high speed and high throughput for the screen of potential active components of traditional Chinesemedicine.

cellmembrane chromatography;comprehensive two dimensional chromatography;SMMC-7721;Hep-G2;Brucea javanica;anti-cancer

O657.7 ［文献标志码］A ［文章编号］1006-0111(2014)06-0425-04

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.007

2014-09-04

2014-10-08［本文编辑］陈静

国家自然科学基金青年项目(12401900802).

纪松岗，博士，主任药师.E-mail:jisonggang@126.com.［通讯作者］柴逸峰，博士，教授.E-mail:yfchai@smmu.edu.cn.