新化合物TG6对心肌缺血/再灌注损伤的影响及机制研究

程晶晶，刘谋治，李洪娇，阎澜，姜远英，颜天华(.武警河南省总队医院药剂科，河南郑州 50000;.中国药科大学药学院，江苏南京 0009;.第二军医大学附属长海医院，上海 00;.第二军医大学药学院，上海 00)

·论著·

新化合物TG6对心肌缺血/再灌注损伤的影响及机制研究

程晶晶1，刘谋治2，李洪娇3，阎澜4，姜远英4，颜天华2(1.武警河南省总队医院药剂科，河南郑州 450000;2.中国药科大学药学院，江苏南京 210009;3.第二军医大学附属长海医院，上海 200433;4.第二军医大学药学院，上海 200433)

目的研究TG6对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及机制。方法采用整体大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)实验，离体大鼠心脏低灌复灌实验和乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤(H/R)实验等模型，以血清CK、LDH、T-SOD、MDA等为指标，研究TG6对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。结果在整体大鼠心肌缺血再灌注损伤实验中，TG6显著减少I/R损伤后心肌梗死面积，减少血清中CK活力和MDA含量，减少LDH活力，增加T-SOD活力;在离体大鼠心脏低灌复灌实验中，TG6显著增加低灌复灌后心肌冠脉流量，减少心肌组织中MDA含量和CK、LDH外漏，提高心肌组织中T-SOD活力;在乳鼠心肌细胞H/R损伤实验中，TG6对正常生长条件下的细胞没有明显影响，提高Na2S2O4制备的心肌细胞H/R模型下细胞的存活率、降低细胞CK的释放率及细胞［Ca2+］i的含量。结论 TG6对心肌I/R损伤有一定的保护作用。

钠氢交换器抑制剂;心肌缺血/再灌注;冠脉结扎;离体心脏灌流;心肌细胞;缺氧/复氧

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是指缺血期处于可逆损伤的心肌细胞恢复血液供应后产生更为严重的损伤，主要包括:炎症反应、内皮细胞损伤、血流障碍、心肌细胞坏死和凋亡所致的心肌梗死面积(MIS)扩大等。随着冠状动脉搭桥术(CABG)、经皮冠状动脉内成形术(PTCA)、溶栓疗法等血管再通术的迅速开展，急性心肌梗死(AMI)再灌注治疗出现了一个飞跃［1］。目前MIRI是阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题，如何减轻MIRI成为临床上的新挑战。

钠氢交换器(Na+-H+exchanger，NHE)是一种在多种哺乳动物细胞中均有表达的蛋白质，它在调节细胞内pH值，维持Na+和Ca2+稳定方面起重要的调节作用［2］。目前，已经有10种NHE亚型(NHE1～NHE10)被确认［3］，其中NHE1在组织中普遍分布，尤其在心肌细胞中占绝大多数，因此NHE1在调节心肌功能方面起重要作用。在对心肌缺血再灌注损伤机制研究过程中发现，心肌在缺血再灌注损伤时可激活NHE，进而引起Na+-Ca2+交换，致细胞内Ca2+超负荷，造成心肌细胞损伤。根据这种病理生理基础研究提示，Na+-H+交换抑制剂(sodium hydrogen exchange inhibitor，NHEI)有可能为防止心肌细胞损伤提供新的治疗方法［4］。

中国药科大学新药研究中心将卡立泊来德(cariporide)分子的有效基团与曲美他嗪分子的有效基团相结合，合成了一系列化合物。经初步筛选，发现化合物TG6作用突出，经查新证实为结构新型的化合物(图1)。

图1 TG6化学结构式

TG6分子可能兼具NHE1抑制剂和代谢类药的特点，其作用机制可能与减轻氧自由基损伤、改善自由基清除系统平衡、扩张冠状动脉、改善心肌能量代谢、抑制细胞内Ca2+超载等有关，有望成为预防和治疗心肌缺血再灌注损伤的新药。本研究旨在观察TG6在缺血再灌注损伤保护方面的作用效果和机制，为其临床应用和进一步研发提供可靠的理论依据和思路。

1 材料和方法

1.1 药品与材料TG6、卡立泊来德、盐酸曲美他嗪均由中国药科大学新药研究中心提供;连二亚硫酸钠(Na2S2O4·2H2O，分析纯，天津市福晨化学试剂厂生产);二甲亚砜(DMSO)，上海凌峰化学试剂有限公司生产;肌酸激酶(CK)测定试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒、丙二醛测定(MDA)试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、超微量Na+，K+-ATP酶测定试剂盒均由南京建成生物试剂有限公司生产。

SD大鼠，雄性，220～250 g(第二军医大学实验动物中心提供，合格证:SCXK(沪)2007-0003)。

1.2 方法

1.2.1 TG6对冠脉结扎造成SD大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的影响大鼠用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，肢体导联监测心电图，记录正常心电图。气管插管，接动物人工呼吸机进行人工呼吸，左侧第4肋间开胸，剪开心包暴露心肌，并用圆形无创缝合针5-0丝线置于左冠状动脉前降支起始部下2 mm处备用。结扎冠状动脉，以ECGⅡ导联ST段抬高或T波高耸、心肌颜色变暗红色为结扎成功的标志［5］。结扎45min后松开结扎线再灌注90min。56只清洁级雄性SD大鼠随机分为7组(每组8只):模型组;假手术组(冠状动脉下只穿线不结扎，其余操作同模型组);卡立泊来德(1 mg/kg)组;曲美他嗪(5 mg/kg)组;TG6高剂量组(1 mg/kg)、中剂量组(0.5 mg/kg)、低剂量组(0.25 mg/kg)。卡立泊来德，曲美他嗪，TG6高、中、低剂量均在再灌注前5 min于尾静脉给予。

1.2.2 TG6对大鼠离体心脏低灌/复灌损伤的影响80只清洁级雄性SD大鼠随机分为8组(n= 10):正常对照组，用改良K-H液以正常流速灌注80 min;模型组，平衡20 min后用改良K-H液低灌30 min，再复灌30 min;溶媒组，低灌液为含0.001%DMSO的改良K-H液，其余同模型组;曲美他嗪组，低灌液为含50μmol/L曲美他嗪的改良K-H液，其余同模型组;卡立泊来德组，低灌液为含10μmol/L卡立泊来德的改良K-H液，其余同模型组;TG6高、中、低剂量组，低灌液分别为含50、10、2μmol/L TG6的改良K-H液，其余均同模型组。实验前将大鼠脱颈处死，迅速开胸，快速取下心脏放入改良的K-H缓冲液冰浴中洗净残血，迅速主动脉插管悬挂心脏于改良的Langendorff灌流装置上［5］，用改良的K-H缓冲液(以95%O2和5%CO2饱和)行主动脉逆行灌流(速度5～7 ml/min)，温度稳定在37℃，然后依据各组别进行处理。

1.2.3 TG6对乳鼠心肌细胞缺氧再复氧损伤的影响体外培养原代乳鼠心肌细胞［7］，采用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)引起的心肌细胞缺氧/复氧模型来考察TG6对缺氧/复氧损伤的影响［8］。TG6在复氧前给予，MTT法测定心肌细胞存活率，并测定细胞培养液中肌酸激酶(CK)含量以及细胞中Ca2+的含量。

1.2.4 统计学分析实验数据用¯x±s表示。采用SPSS11.0统计软件进行分析，单因素方差分析进行组间显著性比较，两组间样本均数比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TG6对冠脉结扎造成SD大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的影响

2.1.1 TG6对大鼠心肌梗死范围的影响假手术组的心肌梗死区不明显，而缺血再灌注模型组的心肌梗死范围明显(P＜0.01)。给药组各组不同程度地减少了心肌梗死范围，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。结果显示，TG6对冠脉结扎所致缺血再灌注损伤有明显的保护作用。结果见图2。

图2 TG6对缺血45m in后再灌注90 m in的大鼠心肌梗死范围的影响(n=8，¯x±s)

2.1.2 TG6对大鼠血清中CK、LDH、T-SOD活力及MDA含量的影响模型组血清中CK、LDH活力、MDA的含量明显高于假手术组，T-SOD活力明显低于假手术组，两者相比有显著性差异(P＜0.01)。TG6高剂量组血清中CK、LDH、T-SOD活力、MDA含量分别与卡立泊来德组、曲美他嗪组比较，无显著性差异(P＞0.05)。TG6投给剂量越大，血清中CK、LDH活力和MDA含量越低，T-SOD活力越高。结果显示，TG6具有抗氧化损伤、减少过氧化产物的作用，可减少缺血再灌注引起的心肌细胞膜损伤。结果见图3、图4。

图3 TG6对缺血45m in后再灌注90 m in的大鼠血清中LDH、CK和SOD含量的影响(n=8，¯x±s)

2.2 TG6对离体大鼠心脏低灌复灌的影响模型组复灌初和复灌末的冠脉流量明显低于对照组(P＜0.01)。溶媒组与模型组无明显差异(P＞0.05)。各给药组的复灌初和复灌末的冠脉流量都明显高于模型组(P＜0.05，P＜0.01)。结果显示，TG6有扩张冠状动脉的作用，见图5。模型组心肌组织中的

图4 TG6对缺血45m in后再灌注90 m in的大鼠血清中MDA含量的影响(n=8，¯x±s)

图5 TG 6对30 m in低灌后再复灌30 m in的离体大鼠心脏冠脉血流量的影响(n=8，¯x±s)

CK、LDH、T-SOD活力明显低于对照组(P＜0.01)，而MDA含量明显高于对照组(P＜0.01)。溶媒组与模型组比较无明显差异(P＞0.05)。各给药组心肌组织中的CK、LDH、T-SOD活力都明显高于模型组(P＜0.05，P＜0.01)，而MDA含量低于模型组(P＜0.05，P＜0.01)。TG6高剂量组心肌组织中的CK、LDH、TSOD活力和MDA含量分别与曲美他嗪组和卡立泊来德组相比均无明显差异(P＞0.05)。结果进一步提示，TG6对离体心脏的缺血再灌注损伤也有保护作用，见图6、图7。

图6 TG6对30 m in低灌后再复灌30m in的离体大鼠心脏中CK、LDH和T-SOD活性的影响(n=8，¯x±s)

图7 TG6对30 m in低灌后再复灌30m in的离体大鼠心脏中MDA含量的影响(n=8，¯x±s)

2.3 TG6对Na2S2O4引起乳鼠心肌细胞缺氧再复氧损伤的影响与对照组比较，模型组细胞的存活率明显下降(P＜0.01);同时细胞内CK释放率和Ca2+含量也显著升高(P＜0.01)，均表明心肌细胞受到严重损伤、活性下降。复氧前给予药物孵育1 h后，与模型组比较，卡立泊来德组(10-4mol/L)和TG6高、中剂量组(10-4、10-5mol/L)均不同程度地改善了心肌细胞的缺氧/复氧损伤，显著提高了乳鼠心肌细胞的存活率，明显降低了细胞内CK的释放率和Ca2+含量(P＜0.01，P＜0.05)。说明TG6对Na2S2O4引起的缺氧/复氧损伤的心肌细胞有一定的保护作用。结果见表1、表2。

表1 再灌注前给予TG6对乳鼠心肌细胞存活率的影响(n=6，¯x±s)

表2 再灌注前给予TG6对Na2 S2O4损伤的乳鼠心肌细胞中Ca2+含量及CK释放率的影响(n=6，¯x±s)

3 结论

综上所述，笔者通过整体大鼠冠脉结扎缺血及再灌注实验，首次发现TG6能减轻心肌缺血再灌注损伤，具有减少自由基损伤的作用;通过离体大鼠心脏低灌复灌实验，首次发现TG6改善心肌缺血再灌注损伤的机制还与扩张冠状动脉、改善心肌组织能量代谢有关;通过乳鼠心肌细胞实验，首次发现TG6对心肌细胞的缺氧/复氧损伤有保护作用，可以稳定细胞膜、减少细胞内Ca2+超载。结果显示，TG6对心肌缺血再灌注具有显著的保护作用。

［1］石燕燕，李树青.心肌缺血再灌注损伤治疗进展［J］.中国心血管病研究，2007，5(10):777-779.

［2］胡若愚.钠氢通道抑制剂在心脏缺血再灌注损伤中的保护作用［J］.实用医学杂志，2006，22(24):2931-2933.

［3］Lee SH，Kim T，Park ES，etal.NHE10，a novel osteoclast-specific member of the Na+-H+exchanger family，regulates osteoclast differentiation and survival［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，369(2):320-326.

［4］Kim JC，Woo SH.Role of Na+-H+exchange in themodulation of L-type Ca2+current during fluid pressure in rat ventricularmyocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，431(2):239-245.

［5］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2002:1042-1052.

［6］戴小燕，方秋娟.Langendorff离体心脏灌注模型的制备及应用［J］.医学综述，2012，(13):2036-2039.

［7］司徒镇强，吴军正.细胞培养［M］.2版，世界图书出版公司，2008:200-201.

［8］许蜀闽，王培勇，马红英，等.连二亚硫酸钠在建立培养细胞的无氧环境中的应用［J］.第三军医大学学报，2005，27(4): 359-360.

［9］张新宁，吕琪，张永亮，等.大鼠心肌缺血再灌注模型建立方法的改进［J］.武警医学院学报，2008，17(11):941-943.

［10］周燕.心肌损伤标志物的研究进展与心肌梗死的诊断标准［J］.临床医学，2009，22(12):2860-2862.

［11］Zhu X，Zuo L.Characterization of oxygen radical formation mechanism at early cardiac ischemia［J］.Cell Death Dis，2013，4:e787.

［12］赵芳，徐立，许立.参附注射液对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的作用［J］.中药新药与临床药理，2007，18(1):17-19.

［13］王丽艳，刘艳，李丹露，等.胆碱对离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用［J］.中国药理学通报，2007，23(5):600-603.

［14］许蜀闽，王培勇，马红英，等.连二亚硫酸钠在建立培养细胞的无氧环境中的应用［J］.第三军医大学学报，2005，27(4): 359-360.

［15］Shintani-Ishida K，Inui M，Yoshida K.Ischemia-reperfusion inducesmyocardial infarction through mitochondrial Ca2+overload［J］.JMol Cell Cardiol，2012，(53):233-239.

Effects and mechanism of TG6 on m yocardial ischem ia and reperfusion injury

CHENG Jingjing1，LIU Mouzhi2，LIHongjiao3，YAN Lan4，JIANG Yuanying4，YAN Tianhua2(1.Department of Pharmacy，Henan People＇s Armed Police Corps Hospital，Zhengzhou 450000，China;2.School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China;3.Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University，Shanghai 200433，China;4.School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

Objective Toinvestigate the protective effects and mechanism of TG6 onmyocardial ischemia/reperfusion injury.Methodsthe protective effects of TG6 on myocardial ischemia/reperfusion was investigated by setting up models of ischemia and reperfusion of rats induced by ligating the left coronary anterior descending artery in vivo，isolated rathearts through an improved Langendorff device，and hypoxia/reoxygenation injury of neonatal rat cardiomyocytes，and the serum CK，LDH，T-SOD，MDA were taken as research markers.ResultsTG6 significantly reduced themyocardial infarct size，decreased the activity of CK and the content of MDA in serum，reduced the activity of LDH，and increased the activity of T-SOD in vivo;TG6 obviously increased the coronary blood flow after low rate perfusion and reperfusion，decreased the contentofMDA and the leakage of CK，LDH inmyocardial tissue，elevated the activity of T-SOD in vitro of isolated rat hearts;TG6 had no effects on cells in normal growth condition，raised the viability of cardiomyocytes significantly，and reduced the rate of CK leakage and the content of［Ca2+］iobviously in Na2S2O4treated cells in vitro of neonatal rat cardiomyocytes.ConclusionTG6 could effectively protectmyocardial ischemia/reperfusion injury.

NHEI;myocardial ischemia/reperfusion;coronary artery ligation;isolated heart perfusion;cardiomyocyte;H/R

R541.6 ［文献标志码］A ［文章编号］1006-0111(2014)06-0440-04

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.010

2013-10-09

2014-03-19［本文编辑］李睿旻

“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09103101-069).［作者简介］程晶晶，药师.Tel:18625598588，E-mail:jinganswer_890721 @126.com.

颜天华.E-mail:yth0001@126.com.