应用RRLC-TOFMS技术快速鉴别中药艾叶中的化学成分

李玲，吕磊，董昕，吕狄亚，娄子洋(.第二军医大学药学院分析测试中心，上海 00433;.第二军医大学附属东方肝胆外科医院药材科，上海 00438)

·论著·

应用RRLC-TOFMS技术快速鉴别中药艾叶中的化学成分

李玲1，吕磊2，董昕1，吕狄亚1，娄子洋1(1.第二军医大学药学院分析测试中心，上海 200433;2.第二军医大学附属东方肝胆外科医院药材科，上海 200438)

目的应用快速液相色谱-高分辨飞行时间质谱(RRLC-TOFMS)技术对中药艾叶中化学成分进行快速鉴别。方法色谱分离采用Agilent Eclipse C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8μm);流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱，A相随时间的变化:5%～30%(0～12min)，30%～80%(12～25min)，80%(25～30min)，进样量1μl，流速0.35ml/min，柱温40℃。TOFMS、电喷雾离子源(ESI)、正离子模式、质量数扫描范围m/z100～1500。结果 一次性鉴别出艾叶中31种化学成分。结论建立基于RRLC-TOFMS技术对艾叶中化学成分快速鉴别的方法，为中药艾叶的质量控制及体内的深入研究奠定基础。

快速液相色谱;艾叶;化学成分;飞行时间质谱

艾叶为菊科植物艾Artemisia argyi(Levi.et)Vant的干燥叶，性温，味苦、辛，在我国民间广泛用于治疗养病、食用充饥、辟邪驱毒［1］。《本草纲目》记载:艾叶具有温经活络、驱寒止痛、美容养颜、延缓衰老的功能。艾叶的主要成分为挥发油，其次还含有黄酮类、甾醇类、多糖类、鞣质、微量元素及其他成分，其主要药理作用包括抗菌、抗病毒、平喘镇咳、抗过敏、抗凝血、增强免疫能力、护肝利胆等［2，3］。目前关于艾叶化学成分研究的报道较多［4，5］，但多局限于采用GC或GC-MS技术对其挥发性成分的分析，对于其中的非挥发性成分研究较少。现代药理研究证明，药材中所含各种化学成分具有不同的药理作用［6］，确定艾叶色谱图中各个色谱峰归属，对艾叶药材的质量控制及体内的深入研究具有重要意义。

随着现代分析技术的发展，液质联用技术在中药化学成分的分析鉴别中担当了越来越重要的角色。高分辨飞行时间质谱(TOFMS)具有检测灵敏度高、测定化合物离子范围宽等优点，可以在短时间获得化合物的准确相对分子质量，通过比对已建立的已知化学成分数据库，对被测成分进行快速分析鉴别，相比传统的中药分离手段具有显著的优越性，现已广泛用于中药及复方化学成分的鉴别分析［7，8］。本研究首次采用RRLC-TOFMS联用技术，对艾叶药材中各化学成分进行了快速分析和鉴别，为艾叶药理作用的进一步研究和资源的合理利用奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 仪器Agilent Infinity1290系列快速液相色谱仪(美国安捷伦公司)，配有在线脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱;Agilent 6538四级杆-飞行时间串联质谱仪(美国安捷伦公司)，配有标准电喷雾离子源(ESI)，分析软件为MassHunter在线工作站和Qualiative Analysis离线分析软件。Mettler AE240型十万分之一电子天平(瑞士梅特勒公司);Kudos-SK2200H超声发生器(上海科导超声仪器公司)。

1.2 药品与试剂绿原酸、金丝桃苷、木犀草素和槲皮素对照品均购自中国药品生物制品检定所(纯度＞99.0%)，艾叶药材购自上海雷允上大药房(批号20110803)，经第二军医大学药学院生药学教研室黄宝康副教授鉴定为菊科植物Artemisia argyi(Levi. et)Vant的干燥叶。乙腈和甲酸为色谱纯(Fisher，USA)，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

1.3 对照品溶液的制备精密称取绿原酸、金丝桃苷、木犀草素和槲皮素对照品5.05、5.12、5.20及5. 07 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释定容，配成浓度分别为505、512、520和507μg/ml的混合母液，精密吸取母液1 ml置100 ml量瓶，加甲醇定容后，即得对照品混合溶液。

1.4 样品溶液的制备精密称取艾叶药材粉末0.5 g，加70%乙醇20 ml置于50 ml具塞锥形瓶中，超声60min，过滤，取续滤液，10 800 r/min离心10min，取上清液，即为样品溶液。

1.5 色谱条件色谱柱:采用Agilent Eclipse C18柱(2.1mm×100mm，1.8μm)。流动相:乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱，A相随时间的变化:5%～30%(0～12min)，30%～80%(12～25 min)，80%(25～30min);质谱采集时间25 min。柱平衡时间5 min;进样量1μl;流速0.35ml/min;柱温40℃。

1.6 质谱条件采用ESI源，正离子模式，雾化气为高纯氮气。具体质谱参数:毛细管电压4 000 V，雾化气压力45psi，干燥气流速11L/min，干燥气温度350℃，碎片电压120V;质量数扫描范围m/z 100～1 500;参比离子m/z 121.050 8、m/z 922.009 7。测定样品之前，使用调谐液校准质量轴，以保证质量精度误差＜1×10-6。

1.7 艾叶化学成分数据库的建立根据国内外专业数据库Pubmed、Chem Spider、中国科学院化学专业数据库及国内外相关研究文献［9-13］，收集了艾叶各种化学成分名称及分子式共82个。采用安捷伦Formula-database generator软件(含各元素精确质量数)，根据各成分碳、氢、氧的个数，计算精确相对分子质量，建立了包括化合物名称、分子式、精确相对分子质量、M+H和M+Na准分子离子峰相对分子质量的相应化学成分数据库。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化首先考察了提取方法，本实验选择操作较简便的乙醇超声提取法。分别考察了甲醇、无水乙醇、70%乙醇，发现采用70%的乙醇提取获得的峰容量最大，故采用70%乙醇超声为提取方法。对色谱条件的摸索考察了甲醇-水、乙腈-水系统，发现在乙腈-水系统中基线稳定，洗脱效果优于甲醇-水系统，且各色谱峰分离效果更好，若加入0.1%甲酸可以提高质谱响应。故采用乙腈-水(0.1%甲酸)为流动相。

2.2 艾叶药材TOFMS总离子流图将艾叶样品溶液进样分析，采集RRLC-TOFMS总离子流图，如图1所示。从图中搜索出31个色谱峰的相对分子质量与已知化合物的数据库相符，大部分化合物在正离子模式下的质谱图显示［M+H］+，［M+Na］+。

图1 艾叶药材TOFMS总离子流图

2.3 利用对照品鉴别化合物实验收集艾叶中4个相关化学成分对照品:绿原酸(chlorogenic acid)、金丝桃苷(hyperoside)、木犀草素(luteolin)和槲皮素(quercetin)，混标进样后，结合文献报道［14，15］，无偏差地鉴别出峰3、峰8、峰15和峰22，混合对照品的EIC图见图2。

图2 艾叶混合对照品TOF/MS提取离子流图

2.4 利用精确质量数和同位数分布鉴别化合物以峰7芸香苷(rutin)和峰24异泽兰黄素(eupatilin)为例，说明艾叶乙醇提取物色谱峰的鉴别过程。峰7保留时间为7.22min，该峰的准分子离子［M+H］+为611.161 1，［M+Na］+为633.141 9，利用Qualiative A-nalysis数据分析软件的计算工具，比对自建的化合物数据库中已知化合物的质荷比，确定元素组成分别为C27H31O16和C27H30O16Na。计算C27H31O16和 C27H30O16Na的核素分布情况，与实际得到的质谱图信息进行比对，从图3(A1、A2)可知核素分布的实测值与理论值吻合良好，确定此峰为芸香苷。同理可得，保留时间16.27min的24号峰为异泽兰黄素，该峰的准分子离子［M+H］+为345.097 9，［M+Na］+为367.079 4，其核素分布情况如图3(B1、B2)所示。

图3 芸香苷(峰7)和异泽兰黄素(峰24)的准确质量及核素分布图

2.5 艾叶中化学成分的鉴别根据飞行时间质谱测得的精确相对分子质量，比对所建数据库，应用Qualiative Analysis质谱分析软件计算分子组成，将实测值与理论值进行比对(误差＜3×10-6)，结合文献［9-13］报道，对艾叶所得色谱图上色谱峰进行分析，初步鉴别出31个化学成分(表1)，对部分同分异构体，后期可考虑调节碎片电压获得化合物的裂解规律以进行进一步区分。

表1 艾叶药材中各化学成分的RRLC-TOFMS分析结果

续表 1

3 结论

本实验首次运用RRLC-TOFMS技术对艾叶药材中的化学成分进行快速分离和鉴别，初步鉴别出31个化学成分，其中包括黄酮类、内酯类及其他成分。该方法在指纹图谱研究的基础上对色谱峰进一步明确化，为艾叶药理作用的进一步深入研究和资源的合理开发利用奠定了基础。

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Rapid identification of chem ical com ponents in Artem isiae argyi folium by RRLC-TOFMS

LILing1，LüLei2，DONG Xin1，LV Diya1，LOU Ziyang1(1.Pharmaceutical Analysis Center，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai200433，China;2.Department of Pharmacy，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital affiliated to Second Military Medical University，Shanghai200438，China)

Objective Toidentify the chemical components in Artemisiae argyi folium by rapid resolution liquid chromatography-time of flightmass spectrometry(RRLC-TOFMS).MethodsThe separation was performed on an Agilent Eclipse C18column (2.1 mm×100 mm，1.8μm).Themobile phase consisted of acetonitrile(A)and 0.1%formic acid(B)were in gradient elution. The flowing rate was 0.35m l/min，the injection volumewas 1μl and the temperature of column was 40℃.Time of flightmass spectrometer(TOFMS)with electro spray ion source(ESI)was applied to qualitative analysis under the positive ion mode，and mass scan range was m/z 100-1 500.Results31 chemical compounds in Artemisiae argyi folium were identified unequivocally.ConclusionA rapid and efficient RRLC-TOFMSapproach for identifying the chemical constituents of Artemisiae argyi folium had been successfully established，which paved a way for quality control and further in vivo studies of Artemisiae argyi folium.

RRLC;Artemisiae argyi folium;chemical components;TOFMS

R931.5 ［文献标志码］A ［文章编号］1006-0111(2014)06-0448-05

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.012

2013-06-09

2013-11-13［本文编辑］李睿旻

李玲，实验师.E-mail:316262150@163.com.

娄子洋.Tel:(021)81871335，E-mail:louziyang@126.com.