养正消积胶囊对CaEs-17细胞成瘤组织及对荷瘤裸鼠生存状态与白细胞分类的影响

符文明张爱琴范丽萍彭进文

1浙江中医药大学附属第二医院中医科 杭州 310005 2浙江省肿瘤医院中医科

养正消积胶囊对CaEs-17细胞成瘤组织及对荷瘤裸鼠生存状态与白细胞分类的影响

符文明1张爱琴2范丽萍1彭进文1

1浙江中医药大学附属第二医院中医科 杭州 310005 2浙江省肿瘤医院中医科

目的 探讨养正消积胶囊对荷瘤裸鼠食管鳞癌的抑制作用及对其生存状态、白细胞计数及分类的影响。方法 食管鳞癌CaEs-17细胞株经培养并接种于裸鼠皮下，随机分组后给予低、中、高剂量的养正消积溶液灌胃，并与顺铂对照。观察荷瘤裸鼠生存状况，测量肿瘤抑制率，检测裸鼠白细胞计数及分类。结果 养正消积胶囊对荷瘤裸鼠食管癌组织具有抑制作用，对其日常生活质量、白细胞、淋巴细胞数量具有维持作用，与顺铂组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 养正消积胶囊能抑制荷瘤裸鼠食管癌组织增殖，有利于改善其生存状态与白细胞水平。

裸鼠；食管癌；养正消积胶囊；肿瘤抑制率；白细胞分类

图1 模型组（HE×200）

图2 顺铂组（15mg/kg）（HE×200）

图3 养正消积低剂量组（1mg/kg）（HE×200）

图4 养正消积中剂量组（2mg/kg）（HE×200）

图5 养正消积高剂量组（4mg/kg）（HE×200）

养正消积胶囊作为抗癌新药，目前对食管癌的体内实验结果尚无报道。我们采用食管癌CaEs-17细胞株培养并接种于BALB/c裸鼠皮下造模，通过测量肿瘤抑制率，观察裸鼠生存状况，检测裸鼠白细胞分类，发现养正消积胶囊对食管癌组织具有增殖抑制作用，有利于改善荷瘤裸鼠生存质量，报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 健康BALB/c雄性裸鼠54只，体质量18～22g，购自上海西普尔·必凯实验动物有限公司，合格证号：2008001630244。CaEs-17细胞，购自中科院上海细胞研究所。

1.2 药 物 养正消积胶囊药粉（规格：0.39g/粒），由石家庄以岭药业股份有限公司馈赠。顺铂（批号WA2A1209056，规格：20mg/支），购自齐鲁制药有限公司。

1.3 试剂及仪器 RPMI-1640培养液、0.25%胰蛋白酶，购自Gibico公司。刘A液、刘B液，购自珠海贝索生物技术有限公司。苏木精、伊红，购自上海善普科技有限公司。Coulter LH750全自动血细胞分析仪,购自美国贝克曼库尔特公司。光学显微镜，购自日本Olympus公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养与造模 从液氮中取出含CaEs-17细胞株冻存管，37℃水浴中快速解冻后移入无菌操作台内。将解冻的细胞悬液加入含有10mLD-Hanks液的离心管内，1000rpm离心5min后，移去上清液，加入RPMI 1640培养基（含有10%胎牛血清，100U/ mL青霉素、100U/mL链霉素）混合均匀后，放入37℃、5%CO2培养箱中进行培养。取对数生长期的CaEs-17细胞，用2mL 0.25%胰蛋白酶和0.02%依地酸消化后，收集细胞悬液，计数并调整细胞浓度为1× 107/mL细胞。全部54只裸鼠用随机数字逐个编号，选数字最小者8只作为正常组；其余46只裸鼠按每只0.2mL标准接种CaEs-17细胞悬液于右腋皮下。接种后第7天，对接种裸鼠按序编号，每天用卡尺测量肿瘤组织的最长径L（mm）和垂直方向的最大横径W（mm）1次以计算肿瘤体积V（mm3）（=L×W2/2）。第10天肿瘤体积增至100～270mm3左右。

2.2 分 组 按肿瘤体积将裸鼠分为大（201～270mm3）、中（100～200mm3）、小（＜100mm3）三组，其中肿瘤体积最小的1只，用颈椎脱臼法处死；肿瘤体积大的5只和中的40只用随机数字分别编号后根据数字由小到大依次分成模型组、顺铂组和养正消积胶囊低、中、高剂量组，每组9只。分组次日，除模型组外，另四组分别予以顺铂腹腔注射、养正消积胶囊灌胃处理。全部裸鼠均在SPF环境中继续饲养。

2.3 给 药 养正消积胶囊每粒重0.39g，成人用量为每次4粒，每天3次。按《中药药理研究方法学》中用量折算方法，以成人用量折算成裸鼠低剂量组，得出养正消积低、中、高剂量组裸鼠每天生药用量分别为0.02、0.04和0.08g。用生理盐水调浓度为0.05、0.1和0.2g/mL，使每只裸鼠每天灌胃养正消积悬液用量均为0.4mL；顺铂组将20mg顺铂溶解入20mL生理盐水中，隔日裸鼠腹腔注射0.3mL；模型组与正常组裸鼠饲养过程中不给任何药物。给药时间为30天。

2.4 检测指标及方法 ①各组裸鼠的精神、活动、饮食、皮色、排便及死亡情况。并在首次及末次给药当天各称重1次；②末次给药后第3天，颈椎脱臼法处死全部裸鼠并完整剥取肿瘤组织，用电子天平称肿瘤重量并计算抑瘤率[=（模型组平均重量-治疗组平均重量）/模型组平均重量×100%]；摘眼球采血法采集每组裸鼠血液送化验室进行白细胞计数；从每个血标本中取一滴血液，编号后做血液涂片及白细胞分类。血涂片制作法：刘A液（主要含曙红、甲醇）约0.8mL滴在血液涂片上染色30s后加刘B液（主要含亚甲蓝）于刘A液上，吹耳球吹液使混和充分。2min后，自来水冲去染色液。待涂片干燥后，200倍光学显微镜拍照，1000倍油镜下计数100个血细胞，找出中性粒细胞（N）、淋巴细胞（L）与单核细胞（M），并换算成百分比；③各组肿瘤组织编号后予以福尔马林固定、石蜡包埋、切片并按说明书进行苏木精-伊红染色（HE染色），200倍光镜下拍照。

2.5 统计学方法 应用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料数据用均数±标准差（±s） 表示，多个样本之间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

3 实验结果

3.1 大体观察与病理结果 正常组裸鼠精神饱满，活动正常，皮色光泽，饮食正常，排便未见异常，未见死亡。模型组裸鼠随着肿瘤体积增大，饮食量增大，排便未见异常，日常活动量有所减少、精神状态未见异常，皮色光泽，身体偏胖。顺铂组裸鼠随着肿瘤体积增大，精神状态明显下降，饮食量减少，皮肤菲薄，干燥起皱，身体消瘦，其中1只死于无法进食。养正消积低、中、高剂量组裸鼠随着肿瘤体积增大，仍精神饱满，日常活动、饮食、排便、皮色无异常改变。低剂量组裸鼠因打架死亡1只。各组裸鼠移植瘤组织病理结果见图1～5（插页）。

3.2 各组裸鼠平均体质量比较 给药前顺铂组与其余各组裸鼠平均体质量差异无统计学意义（P＞0.05）；给药后顺铂组裸鼠平均体质量显著低于其余各组（P均＜0.01）。见表1。

表1 各组裸鼠平均体质量比较（±s）

表1 各组裸鼠平均体质量比较（±s）

注：与顺铂组比较，*P＜0.01

组别正常组模型组顺铂组低剂量组中剂量组高剂量组n/只 剂量/（mg/kg） 平均体质量/g 898899 --1 5124给药前23.94±1.85 23.64±1.69 23.52±1.51 23.47±1.62 23.21±1.25 23.36±1.42给药后26.89±2.78* 27.16±1.62* 18.66±1.66 25.23±2.42* 25.80±1.46* 25.63±2.39*

3.3 各组裸鼠平均瘤重及抑瘤率比较 与模型组比较，各给药组平均瘤重明显下降（P＜0.05，P＜0.01）；以40%为标准，抑瘤率以顺铂组最高，其次为养正消积低剂量组，养正消积中、高剂量组未达标。见表2。

表2 各组裸鼠平均瘤重及抑瘤率比较（±s）

表2 各组裸鼠平均瘤重及抑瘤率比较（±s）

注：与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

瘤率/% --50.76 40.39 26.78 24.83

3.4 各组裸鼠血白细胞总数及分类比较 与模型组比较，养正消积低剂量组血白细胞总数（WBC）、单核细胞（M）百分比明显增高（P＜0.05，P＜0.01），顺铂组中性粒细胞（N）百分比增高，淋巴细胞（L）百分比降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，养正消积低、中、高剂量组中性粒细胞（N）百分比降低（P＜0.01），淋巴细胞（L）百分比增高（P＜0.01），见表3。

表3 各组裸鼠白细胞计数及分类比较（±s）

表3 各组裸鼠白细胞计数及分类比较（±s）

注：与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与顺铂组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别正常组模型组顺铂组低剂量组中剂量组高剂量组n/只898899 WBC/×109/L 6.32±1.32 7.46±1.42 8.18±0.90 9.36±2.23△8.34±2.12 9.74±1.43△N/% 50.0±11.11 67.0±14.76 79.8±4.76△△58.8±4.15** 62.8±4.87** 59.8±8.14** L/% 43.80±14.13 25.40±15.71 11.4±4.83△△27.6±3.78** 27.6±9.34** 28.2±6.87** M/% 4.2±3.77 5.8±3.19 8.8±5.81 13.6±1.82△△* 9.6±6.35 12.0±3.16△*

4 讨论

目前食管癌的最佳化疗方案与最佳剂量仍不明确。但一般认为，顺铂的疗效比较确切[1-2]。养正消积胶囊为抗癌中成药，由黄芪、女贞子、莪术、人参、白术、灵芝、绞股蓝、土鳖虫、半枝莲、蛇舌草、白英、蛇莓、茵陈、徐长卿、鸡内金组成。方中黄芪、人参、灵芝、女贞子、绞股蓝，健脾补肾、益气养阴以扶正，使脾肾功能健旺，发挥“养正积自消”之功；土鳖虫、莪术逐瘀散结通络；半枝莲、蛇舌草、白英、蛇莓解毒抗癌以攻邪；徐长卿通络止痛，鸡内金健胃消积，茵陈舒畅气机。养正消积胶囊的组方原则与中医对该病的治疗方法[3]基本一致。

药物的抗癌作用是通过抑瘤率来衡量的，根据《中药药理研究方法学》，抑瘤率以＞40%为有效[4]。HE染色结果表明，各组裸鼠组织细胞符合恶性肿瘤细胞特点。本研究结果显示，顺铂和养正消积胶囊均具有抑制肿瘤组织增殖的作用，以顺铂效果最佳。随着养正消积胶囊剂量的加大，抑瘤率反而下降，此现象说明养正消积胶囊不存在剂量疗效的线性关系。

癌症的治疗应重视患者的生存质量。通过观察不同给药方法对荷瘤裸鼠生活状况及体质量的影响，可见顺铂组裸鼠生存质量较差，体质量下降明显（P＜0.01），并出现裸鼠无法进食而死亡现象，而养正消积胶囊各组则无此现象。

顺铂存在骨髓抑制，胃肠道反应等副作用。而维持一定数量的白细胞对机体防御感染、消除肿瘤细胞甚至治愈肿瘤具有重要意义[5]。本研究结果显示，顺铂有升高中性细胞数（P＜0.05）并降低淋巴细胞数（P＜0.05）的作用，而养正消积胶囊则有维持中性细胞与淋巴细胞数的作用，高、低剂量养正消积胶囊尚能增加单核细胞数（P＜0.01）；与顺铂组相比，养正消积胶囊在降低中性细胞、升高淋巴细胞与单核细胞数上存在明显优势（P＜0.01或P＜0.05）。这有利于维持机体的固有免疫力，有利于荷瘤裸鼠的生存。

中医十分强调正气在疾病治疗中的作用，认为攻邪不能伤正，扶正也能消积。养正消积胶囊主要由扶正与攻邪两类药物组成，方中半枝莲、白花蛇舌草、白英、蛇莓为苦寒之品，剂量倍增，更损伤正气，反而影响总体疗效。这一现象提示我们，对苦寒伤正中药的运用应把握有度。过度化疗有害，中药过度“抗癌”也可能无益，正气受损最终会影响抗癌疗效。

［1］孙燕，石远凯.临床肿瘤内科手册［M］.第5版.北京：人民卫生出版社，2012：470.

［2］Bleiberg H，Conroy T，Paillot B，et al.Randomised phase two study of Cisplatin and 5-Flurouracil versus Cisplatin alone in advanced squamous cell oesophageal cancer［J］.Eur J Cancer 1997，33（8）：1216-1220.

［3］王永炎，麟兆麟.中医药学高级丛书·中医内科学［M］.第2版.北京：人民卫生出版社，2011：428-429.

［4］陈奇.中药药理研究方法学［M］.第3版.北京：人民卫生出版社，2011：1235.

［5］金伯泉，熊思东.医学免疫学［M］.第5版.北京：人民卫生出版社，2010：215.

修回日期：2014-09-03

Effect of Yangzheng Xiaoji Capsules on Esophageal Carcinoma CaEs-17 Cell Tissues and the Survival Condition and White Blood Cell Classification of Mice

FU Wenming1,ZHANG Aiqin2,FAN Liping1,PENG Jinwen1. 1.Department of Traditional Chinese Medicine,the Second Hospital affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2.Zhejiang Cancer Hospital.

Objective To investigate the inhibitory effect of Yangzheng Xiaoji capsules on esophageal squamous cell carcinoma and its effect on the condition of survival and white blood cell（WBC）classification of rats.Methods Esophageal carcinoma CaEs-17 cells were cultivated and subcutaneously inoculated in nude mice.Mice with esophageal carcinoma were randomized into three Yangzheng Xiaoji capsule groups with different dosages（low, medium,and high）and one cisplatin group as control.The survival condition of tumor-burdened nude mice were observed.The inhibition rate of tumor was calculated.The number of WBC was determined.Results Yangzheng Xiaoji capsules inhibited the growth of esophageal carcinoma tissues of mice,and consequently improved the survival condition of mice.The number of WBC and lymphocytes in Yangzheng Xiaoji capsule groups were significantly different with that in cisplatin group（P＜0.05）.Conclusion Yangzheng Xiaoji capsules has inhibitory effect on growth of esophageal carcinoma tissues,resulting in improvement of quality of survival and keeping normal number of WBC and lymphocytes.

Nude mice；esophageal carcinoma；Yangzheng Xiaoji capsules；tumor inhibition rate；WBC classification

2014-06-02