急性肺损伤大鼠各组织SP-A含量变化及相关性研究

李志军郑继生李敏静沈延飞蔡宛如

1浙江医院呼吸科 杭州 310013 2浙江省立同德医院呼吸内科3浙江中医药大学附属第二医院呼吸内科 4浙江省东阳市人民医院重症医学科

急性肺损伤大鼠各组织SP-A含量变化及相关性研究

李志军1郑继生2李敏静3沈延飞4蔡宛如3

1浙江医院呼吸科 杭州 310013 2浙江省立同德医院呼吸内科3浙江中医药大学附属第二医院呼吸内科 4浙江省东阳市人民医院重症医学科

目的 通过检测急性肺损伤（ALI）模型大鼠肺、大肠等组织及肺泡灌洗液（BALF）、血清肺表面活化蛋白A（SP-A）含量变化并分析其相关性，为中医“肺与大肠相表里”理论提供实验依据。方法 采用脂多糖（LPS）气道内滴入制备急性肺损伤（ALI）大鼠模型，应用ELISA方法分别检测ALI及药物干预后ALI大鼠肺、大肠等组织及肺泡灌洗液（BALF）、血清SP-A含量变化，并进行相关性分析。结果 随着急性肺损伤加重，ALI模型大鼠肺、大肠、BALF及血清SP-A含量逐渐降低，药物干预后能逆转这种趋势，呈一致性变化。且干预前后肺与大肠SP-A表达具有相关性（r= 0.521，r=0.615，P＜0.01）。结论 SP-A在肺和大肠组织的含量变化相关性最密切。

大鼠；急性肺损伤；肺表面活化蛋白A；肺与大肠相表里

肺表面活化蛋白A（surfactant protein A，SP-A）为肺表面活化蛋白中最早发现及含量最丰富者，是肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS）中最重要的蛋白成分，在维持PS结构和功能、降低肺表面张力、调节肺的免疫防御及炎症反应等方面有重要作用。罗俊铭等[1]研究表明，SP-A相似分子在肠道上皮、肠道绒毛表面，连接组织血管和某些炎症细胞中分布。Rubio等[2]也发现在大鼠肠道上皮细胞中能表达SP-A相似分子，并且其编码序列与肺组织中的SP-A完全一致。结合“肺与大肠表里相合”的中医理论，我们推测SP-A在肺与大肠组织中的表达可能存在着某种相关性，为此进行了相关研究，旨在为中医“肺与大肠相表里”的理论提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动 物 健康雄性SD大鼠120只，清洁级，体质量（200±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供（许可证号：SCXK（沪）2008-0016）。

1.2 试剂及材料 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（批号E.coli内毒素055：B5，美国Sigma公司）；SP-A ELISA试剂盒（美国RND公司进口分装）；RIPA裂解缓冲液（普利莱基因技术有限公司）；蛋白酶抑制剂混合物（达文生物有限公司）。

1.3 药 物 芪冬活血饮由黄芪、麦冬、虎杖、当归按5：3：5：3比例组成，大黄汤由一味大黄组成。由浙江中医药大学制剂室制成，含生药1g/mL，存放4℃冰箱保存。

2 实验方法

2.1 急性肺损伤（acute lung injury，ALI）实验 60只大鼠分为空白对照组、生理盐水组、ALI 12h组、ALI 24h组、ALI 36h组和ALI 48h组，每组10只；ALI造模采用气管内注入 LPS法制备 ALI大鼠模型（0.3mg/kg）[3]，生理盐水（normal saline，NS）组及阴性对照组气管内注入等量NS；空白对照组不作处理。

2.2 急性肺损伤药物干预实验 60只大鼠分为阴性对照组、模型组、芪冬活血饮组、芪冬大黄组、大黄组及地塞米松组，每组10只。ALI造模同上，药物干预方法：①芪冬组在造模前24h、12h及造模后12h分别予芪冬活血饮8g/kg灌胃；②芪冬大黄组在造模前24h、12h及造模后12h分别予8g/kg芪冬活血饮和10g/kg大黄汤灌胃；③地塞米松组在造模前24h、12h及造模后12h分别予地塞米松5mg/kg灌胃；④大黄组在造模前24h、12h及造模后12h分别予大黄汤灌胃10g/kg；⑤阴性对照组及模型组在造模前24h、12h及造模后12h分别予等量生理盐水灌胃。

2.3 标本采集及指标检测 ALI 12h组、ALI 24h组、ALI 36h组、ALI 48h组分别于注入LPS后12、24、36、48h，NS组与空白对照组均于48h后；急性肺损伤干预后各组均在造模后24h，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，采集血清、肺泡灌洗液（BALF）及肺组织标本，组织匀浆获取方法采取既往实验所述[4]。采用ELISA检测各组织SP-A含量。

2.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，正态分布数据用One-way ANOVA检验，予以方差齐性检验，方差齐时组间比较用LSD法，方差不齐时组间比较用Tamhane's T2法。

3 实验结果

3.1 各组大鼠组织SP-A含量比较 随着LPS作用时间延长，肺、大肠组织、BALF及血清SP-A含量呈逐步下降趋势，ALI 12h组、ALI 24h组、ALI 36h组及ALI 48h组均明显低于NS组和空白对照组（P＜0.05或P＜0.01）。ALI 24h组、ALI 36h组及ALI 48h组肺、血清SP-A含量显著低于ALI 12h组（P＜0.05或P＜0.01）；ALI 48h组大肠、BALF的SP-A含量显著低于ALI 24h组（P＜0.01）；皮肤组织SP-A含量随着LPS作用时间的延长变化不明显（P＞0.05）；空白对照组肝组织SP-A含量显著高于其它各组（P＜0.05）；ALI 48h组皮肤组织中SP-A含量最低，与空白对照组、NS组、ALI 12h组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肺、大肠、BALF、血清、皮肤及肝组织SP-A含量比较（±s） ng/L

表1 各组大鼠肺、大肠、BALF、血清、皮肤及肝组织SP-A含量比较（±s） ng/L

注：与NS组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与ALI 12h组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与ALI 24h组比较，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

组别空白对照组NS组ALI12h组ALI24h组ALI36h组ALI48h组n/只10 10 10 10 10 10肺肝176.36±27.81* 236.72±44.86 151.87±24.90* 119.63±11.93*△△▲110.00±12.88*△△▲112.51±10.88**△△▲大肠85.20±8.11 89.03±10.21 74.52±11.01* 72.54±18.48*△△59.76±14.15*△△◇53.29±12.76**△△◇◇BALF 439.17±26.09** 528.04±34.81 456.84±65.78** 404.49±30.48**▲372.79±37.31**△△▲▲348.12±59.44**△△◇◇血清439.00±12.98 473.68±35.21△▲430.67±30.28 394.68±53.36**△△▲389.65±45.53**△△▲388.27±42.21**△△▲皮肤80.41±16.45 88.47±8.31 87.16±9.26 68.93±22.11 74.74±15.28 4.91±14.55*△▲126.77±30.10 82.33±11.53△86.68±8.66△87.58±13.76△80.24±4.97△86.22±6.87△

表2 干预后各组大鼠肺、大肠、血清及BALF SP-A含量比较（±s） ng/L

表2 干预后各组大鼠肺、大肠、血清及BALF SP-A含量比较（±s） ng/L

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与地塞米松组比较，▲P＜0.05；与芪冬大黄组比较，◇P＜0.05

组别阴性对照组模型组DXM组芪冬大黄组芪冬组大黄组n/只10 10 10 10 10 10血清431.09±27.82 332.28±11.18** 400.55±44.73△△380.56±43.78**△△379.87±17.68**△△371.16±45.91**△△BALF 485.29±19.65 375.68±20.41* 433.23±34.50*△443.75±65.42*△411.64±61.00* 404.36±37.11*肺190.75±15.17 120.85±9.33** 179.43±24.02△△178.40±19.39△△158.39±18.96**△△▲◇160.89±8.46**△△▲◇大肠82.36±6.18 64.47±5.67** 78.04±5.39△△75.88±4.68△△71.13±4.57** 69.20±6.58**

3.2 干预后大鼠各组织SP-A含量比较 模型组肺、大肠、BALF及血清SP-A含量较对照组均有不同程度降低（P＜0.05或P＜0.01），经地塞米松、芪冬活血饮、大黄和芪冬活血饮联合大黄药物干预后均有恢复，干预后肺、大肠、BALF及血清中SP-A变化规律具有一致性。见表2。

3.3 ALI大鼠肺组织与其它组织SP-A含量相关性分析 对ALI大鼠肺组织SP-A与BALF、大肠、皮肤、肝组织及血清SP-A表达进行相关性分析，相关系数 r分别为 0.658、0.521、0.445、0.106、0.626，ALI大鼠肺组织SP-A表达与BALF、大肠、皮肤、血清SP-A表达具有相关性（P＜0.01）。ALI大鼠干预后肺组织SP-A与BALF、大肠及血清SP-A含量进行相关性分析，相关系数r分别为0.418、0.615、0.558，均具有相关性（P＜0.01）。

4 讨论

“肺与大肠相表里”理论源于《黄帝内经》，它是中医学论述脏腑表里关系的重要内容之一，《灵枢·本输》篇称这种关系为“肺合大肠，大肠者，传导之府也”，《素问·血气形志》篇称之为“阳明与太阴为表里”。在生理上体现了肺主气和大肠主传导之间的相互作用；病理上体现肺和大肠在病变时相互影响；治疗上体现脏病腑治、腑病脏治、脏腑同治提高临床疗效。尽管该理论在长期的临床实践中行之有效，但仍有必要借助分子生物学手段来深入阐释其内在的本质联系。

本实验结果显示，随着LPS作用时间的延长，ALI大鼠肺及大肠组织、BALF及血清SP-A含量呈逐步下降趋势（P＜0.05或P＜0.01），而皮肤及肝组织不存在上述变化，表明SP-A含量在肺与大肠、血清和BALF中具有一致性变化。进一步对肺组织与BALF、大肠、皮肤、肝组织及血清SP-A含量变化进行相关性分析，提示肺组织SP-A表达与BALF、大肠、皮肤及血清SP-A表达均呈正相关，同肝组织无明显相关（r=0.106，P＞0.05），但在肺外脏器中，同大肠的相关性最密切（r=0.521，P＜0.01）。

笔者发现，LPS气管内局部滴注诱导ALI后24h，肺组织和大肠组织SP-A含量均呈现下降，而这种下降经药物干预后均有不同程度的恢复，提示SP-A在肺组织和大肠组织的表达呈一致性。进一步通过对肺与大肠、血清及BALF SP-A的含量进行相关性分析，结果发现干预后肺组织SP-A浓度同BALF、大肠及血清的SP-A浓度均呈正相关，但与大肠相关最密切。

总之，本实验发现SP-A在肺与大肠含量变化的相关性最密切，提示SP-A可能是中医“肺与大肠相表里”的物质基础之一。

［1］罗俊铭，刘昭前，Chin Y.Eugene.肺表面活化蛋白A相似分子在炎症肠道疾病组织中的过量表达［J］.中南大学学报（医学版），2008，33（11）：979-986.

［2］Rubio S，Lacaze-Masmonteil T，Chailley-Heu B，et al.Pulmonary surfactant protein A（SP-A）is expressed by epithelial cells of small and large intestine［J］.Biol Chem，1995，270：12062-12063

［3］朱耀斌，李晓锋，张燕博，等.急性肺损伤动物模型［J］.中华实用诊断与治疗杂志，2011，25（7）：625-628.

［4］李志军，丁志山，董雷，等.芪冬活血饮对急性肺损伤大鼠肺表面活性蛋白A在肺与大肠表达的影响及相关性研究［J］.中华中医药杂志，2013，28（3）：698-702.

［5］ Liu J，Hu F，Wang G，et al.Lipopolysaccharide-induced expression of surfactant proteins A1 and A2 in human renal tubular epithelial cells［J］.J Inflamm（Lond），2013，10（1）：2.

Change of SP-A in Several Tissues of Acute Pulmonary Injury Rats

LI Zhijun1，ZHENG Jisheng2，LI Min-jing3，SHEN Yanfei4，CAI Wanru3. 1.Department of Respiratory Diseases，Zhejiang Hospital，Hangzhou（310013），China;2.Department of Respiratory Diseases，Zhejiang Provincial Tongde Hospital;3.Department of Respiratory Diseases，the Second Hospital affiliated to Zhejiang Chinese Medical University;4.Department of Severe Diseases，Dongyang People's Hospital.

Objective To detect the change of SP-A in several tissues of rats with acute lung injury（ALI）and further discuss the SP-A correlation in different tissues,so as to provide experimental basis for the Traditional Chinese Medical theory"The lung and large intestine have an exterior-interior relationship". Methods ALI model was made by instilling lipopolysaccharide into in trachea of rats.The level of SP-A was detected by ELISA in lung and large intestine tissues and serum samples and BALF of ALI rats before and after interfering.A correlation analysis was carried out.Results With the aggravation of ALI,the level of SP-A in lung and large intestine tissue,BALF and serum samples were gradually declining,but the deceased was reversed by drug treatment,showing a consistency change.The level of SP-A in lung tissue was correlated with that in large intestine tissue（r=0.521 in ALI and r=0.615 after intervening,P＜0.01）.Conclusion The SP-A in lung tissue is closely related with that in large intestine.

rats；acute lung injury；SP-A；Lung and large intestine have exterior-interior relationship

2014-04-24

修改日期：2014-06-25

浙江省自然科学基金（No.Y2091208）

蔡宛如，Tel：0571-85267000；E-mail：caiwanru@yahoo.com.cn