氨基酸多肽螯合钙的制备及其工艺优化

张 妹， 过世东

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

钙是人体的重要组成物质，是人体中所含各种有机和无机元素排行第五大元素，钙在人体内几乎参与了所有的生命活动。最新的科学研究表明，人体之所以衰老或者发生疾病，与钙的代谢发生紊乱，使细胞内外的钙浓度发生变化密切相关。近年来，越来越多人注意补钙的问题。理想的钙剂应具备钙含量高、吸收效率高、无副作用、服用方便、口感好等特点，若含有人体所需要的多种氨基酸、维生素及微量元素等物质则更为理想。

目前市场上补钙产品吸收率差别不是很大，一般在20%~40%[1]。目前国内外补钙制剂繁多，但无机钙盐占主导地位，无机钙盐价格便宜但吸收率低易在肾脏停留，导致肾结石等疾病，如碳酸钙长期服用可能产生大便干燥、食欲不振、胃疼等副作用。近年来，国内外对补钙制剂的研究集中在有机钙方面，但有机钙盐也存在不同的毒副作用，如乳酸钙长期服用容易产生疲劳；葡萄糖酸钙能引起糖尿病患者血糖升高；醋酸钙能引起腹泻等[2-4]。新型可溶性有机钙，氨基酸钙为代表，其特点是：稳定性好，易吸收；量小高效；长期服用无毒副作用，人体在摄人氨基酸螯合物时，同时摄入了一般食物中往往缺乏的2种营养物质—微量元素和氨基酸，具有双重营养作用在微量摄入时，氨基酸钙中钙的吸收不是以离子形式而是以整个螯合物形式被吸收的，是一种较为理想的钙制剂。作者以鱼蛋白酶解液与骨粉钙制备螯合钙，通过单因素实验和正交试验，得出较佳的螯合条件，为开发鱼类下脚料增加其附加值提供参考，为开发钙营养添加剂的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

鱼下脚料：广西百洋集团提供；钙离子溶液、鱼蛋白水解液：自制；酸性蛋白酶：无锡锐阳生物有限公司产品；无水乙醇，盐酸、氢氧化钠均为分析纯试剂。

1.2 主要仪器和设备

万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司产品；超微粉碎机：桓台东奇粉体有限公司产品；DSHZ-300水浴恒温振荡器：江苏太仓市实验设备厂产品；冷冻干燥机：美国热电公司产品；原子吸光光谱仪：东芝株式会社产品；傅里叶变换红外光谱仪：美国赛默飞公司产品；DL-5离心机：上海安亭科学仪器厂产品。

1.3 实验方法

1.3.1 骨钙溶出工艺流程 鱼骨→干燥→粗粉碎→超微粉碎→盐酸酸解→离心分离→过滤→游离钙溶液

1.3.2 螯合工艺流程 酶解液、游离钙→调节pH、温度、时间、质量比→搅拌螯合→一定体积比的无水乙醇→离心去上清液→干燥→粉碎→产品

1.4 指标的测定方法

水解度：电位滴定法；钙的测定：原子吸光光度计；螯合物的定性：红外光谱法。

2 结果与分析

2.1 产物的鉴定

取1~2 mg干燥的氨基酸多肽样品和干燥的螯合钙产物分别与干燥的KBr（A R级）粉末（质量约样品的50倍）在玛瑙研钵中研磨成混合细粉末。装入模具内，在压片机压制成片测试，得红外光谱分析图 1，图 2。

图1 氨基酸多肽的红外光谱图Fig.1 Infrared Spectrum of Multi-peptide amino acid

图2 氨基酸多肽螯合钙的红外光谱图Fig.2 Infrared Spectrum of Chelated Products

红外光谱整个范围可分为4 000~1 300 cm-1与1 300~600 cm-1两个区域。4 000~1 300 cm-1区域的峰是由伸缩振动产生的吸收带。由于基团的特吸收峰一般位于此高频范围，并且在该区域内，吸收峰比较稀疏，因此它是基团鉴定工作最有价值的区域，称为官能团区。在1 300~600 cm-1区域中，除单键的伸缩振动外，还有因变形振动产生的复杂光谱，当分子结构稍有不同时，该区的吸收就要细微的差异。这种情况就像每个人的都有不同的指纹一样，因而称为指纹区。

由氨基酸多肽溶液的红外光谱图1与螯合产物的红外光谱图2可见，在特征区，—NH2的吸收峰由3 417.81 cm-1移动到3 424.04 cm-1：C=O的吸收峰由2 959.87~2 928.83 cm-1移动到 2 360.23~2 342.33 cm-1，由两图对比可见，氨基与羧基氧都参与了反应，与钙离子形成配位（p-π）螯合物，证明了螯合钙的生成。

2.2 游离钙制备

将鱼骨清洗，去脂，自然风干，粗粉碎过筛，得100目骨粉，超微粉碎5 min。选择时间、温度、骨粉质量/盐酸体积比、盐酸浓度4个因素进行4因素3水平的正交实验，用L9（34）正交表安排实验并方差分析，结果如表1。

根据表1，可以得出骨钙溶出最佳组合是A1B3C3D3， 因素影响顺序：B＞A＞D＞C。 用最佳组合A1B3C3D3，得到骨钙溶出率为74.7%。因此，骨钙溶出工艺条件是：温度50℃、时间100 min、盐酸浓度4 mol/L、盐酸量12 mL/g骨粉。

2.3 螯合单因素实验

2.3.1 pH对螯合反应的影响 在温度为60℃，氨基酸多肽∶离子钙的质量比为2∶1，螯合时间为60 min，乙醇体积比 7∶1，选取 pH 值 3、4、5、6、7、8、9 做梯度试验。结果见图3。

图3 pH对螯合反应的影响Fig.3 Influence of pH value on Chelate Ratio

由图3可以看出，在pH值为3到5时螯合率不断升高，在pH值5到9呈下降趋势。分析原因为当H+大量存在时，H+将会与Ca+争夺供电子基团，不利于螯合物的生成，当pH超过6以后，OH-与供电子基团争夺Ca+优先结合生成氢氧化钙沉淀，故pH选择在5左右为适宜。

2.3.2 螯合温度对螯合反应的影响 在氨基酸多肽∶离子钙的质量比为2∶1，螯合时间为60 min，pH值 4， 乙醇体积比 7∶1， 选取 30、40、50、60、70、80、90、95℃，做梯度试验。结果见图4。

图4 螯合温度对螯合反应的影响Fig.4 Influence of Temperature on Chelate Ratio

由图4可以看出，温度低于90℃螯合率缓慢上升，而高于90℃时螯合率却急剧下降，当温度为90℃，螯合率达到最高。分析原因可能是鳌合过程是一个动态平衡的反应，当温度上升，加速了反应离子的运动，加大了螯合反应，鳌合反应大于解离反应，所以随着温度的上升螯合率增加，当温度大于90℃时，解离反应大于螯合反应，螯合率呈现下降趋势。故温度选择90℃为适宜。

2.3.3 螯合时间对螯合反应的影响 在温度为60℃，氨基酸多肽∶离子钙的质量比为2∶1，pH值4，乙醇体积比 7∶1， 选取螯合时间，30、60、90、120、150 min做梯度试验，结果见图5。

由图5可以看出，随着时间的延长，螯合率不断升高，但是当时间超过60 min后，螯合率曲线变化平缓。分析原因可能是离子和供电子基团是不停的运动的，并不停的反应，当达到一定时间后，Ca+或者供电子基团达到饱和，螯合率就不再增加。故时间选择在60 min为适宜。

图5 螯合时间对螯合反应的影响Fig.5 Influence of Time on Chelate Ratio

2.3.4 质量比对螯合反应的影响 在温度为60℃，螯合时间为 60 min，pH值4，乙醇体积比7∶1选取氨基酸多肽∶离子钙的质量比为 1∶1、2∶1、4∶1、6∶1做梯度试验，结果见图6。

图6 质量比对螯合反应的影响Fig.6 Influence of mass ratio on chelate ratio

由图6可以看出，随着氨基酸多肽与钙质量比值升高，螯合率明显增加，当比值为4∶1时，螯合率最大，但比值从2∶1往后，螯合率变化很小，比值过大就造成了浪费。当氨基酸多肽与钙质量比值为2∶1为适宜。

2.4 螯合反应的正交实验分析

为了进一步优化螯合工艺，选择时间、温度、钙离子/氨基酸多肽质量之比、pH 4个因素进行4因素3水平的正交实验，用L9（34）正交表安排实验并方差分析，结果如表2。

根据表2，可以得出螯合工艺的最佳组合是A2B2C2D3，因素影响顺序：A＞B＞D＞C。 用最佳组合A2B2C2D3再次试验，得到螯合率为90.83%。因此，螯合工艺最佳条件是：温度80℃、时间60 min、多肽/钙离子质量比为 2.5∶1、pH 为 5。

表2 酸解鱼骨正交试验Table 2 Chelate reaction results of orthogonal test

3 结语

探讨了以罗非鱼下脚料酶解液和骨粉钙螯合，制备氨基酸多肽螯合钙的最优工艺条件，得出以下结论：

1）利用盐酸酸解鱼骨粉的最佳条件：温度50℃、时间100 min、盐酸浓度4 mol/L、盐酸添加量12 mL/g（以骨粉计）。

2）螯合反应的最佳条件：pH 5、时间60 min、多肽液与钙离子质量比2.5∶1、温度80℃。

[1]刘燕萍.营养医生话补钙[M].北京：中国协口医科大学出版社，2003.

[2]韩歆.一粒钙片[M].北京：中国轻工业出版社，2004.

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