大豆脂肪氧合酶强化香菇风味基料的风味成分研究

张 婵 ， 安晶晶 ， 王成涛 *， 文雁君

（1.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京100048；2.北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室，北京100048；3.河南中大生物工程有限公司，河南 郑州451162）

香菇口味鲜美，香味浓郁，营养丰富，是一种高蛋白质、低脂肪、多糖，含多种氨基酸及B族维生素。 香菇是世界第二大食用菌，也是我国特产之一。目前，香菇以鲜食为主，主要加工成品是罐头食品和干制品，加工过程中营养、风味损失严重[1-6]。

蘑菇的挥发性成分种类繁多，主要包括挥发性八碳化合物、含硫化合物以及醛、酸、酮、酯类等，1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、3-辛醇等挥发性八碳化合物是蘑菇最重要的风味物质。其中1-辛烯-3-醇（又名“蘑菇醇”）是蘑菇的关键风味化合物，具有青香、壤香、蜡香和未成熟的果香及牛奶风味。近来发现，蘑菇生长过程中转化生成1-辛烯-3-醇等八碳化合物的重要催化剂是脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX），菇体所含亚油酸等不饱和脂肪酸，在自身体系的脂肪氧合酶作用下，被氧化成氢过氧化物，氢过氧化物再经过体系内氢过氧化物裂解酶、氧化还原酶等作用产生1-辛烯-3-醇等，因此增加1-辛烯-3-醇等风味化合物的来源，有利于提高风味基料的组成。

LOX酶普遍存在于植物中，特别是大豆中提取的脂肪氧合酶活性明显高于其它植物来源[7-9]，成熟大豆中LOX是活性最高的酶，大豆种子中蛋白质质量分数40%左右，其中LOX质量分数为1%～2%。葵花籽油中质量分数90%是不饱和脂肪酸，其中亚油酸占66%左右。为提高香菇风味基料主风味成分的含量，作者拟在香菇均浆液中添加葵花籽油水解液，利用大豆LOX和香菇内源酶系，研究添加大豆脂肪氧合酶和葵花籽油水解液对强化香菇风味基料风味成分效果的影响，优化其工艺参数，为香菇调味品的开发提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜香菇、大豆 北京永辉超市选购；葵花籽油（福临门）：中粮集团产品；1，2-邻二氯苯（色谱纯）、吐温20（分析纯）、正戊烷（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、石油醚（60~90 ℃，分析纯）、四硼酸钠、无水Na2SO4（用前干燥处理）：国药集团化学试剂有限公司产品；邻二氯苯、亚油酸 （质量分数97%）：Alfa Aesar公司产品。

1.2 仪器设备

多功能料理机：荣事达公司产品；高速冷冻离心机：日本日立公司产品；恒温水浴锅：山东鄄城华鲁电热仪器有限公司产品；JJ-1精密增力电动搅拌器：金坛市至翔科教仪器厂产品；UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司产品；pHS-3D精密pH计：上海三信公司产品；RV10型旋转蒸发仪：德国IKA公司产品；Trace ISQ气相色谱-质谱联用仪：美国Thermo Fisher公司产品。

1.3 工艺流程

图1为香菇风味基料的工艺流程。

图1 香菇风味基料的强化工艺流程Fig.1 Technological process of the enhancement of Lentinus edodes flavor

1.4 大豆LOX的提取

利用水浸提法制备大豆LOX粗酶液[10]。大豆研磨成细粉，研磨温度35℃，过60目筛，经冰水预冷的石油醚多次充分浸提，冷风干燥，得到脱脂豆粕。取10 g脱脂豆粕，加100 mL冰水（料液质量体积比1 g∶10 mL）搅拌浸提 1 h。 4 ℃，6 000 r/min离心 30 min，上清液即为粗酶液，测定其约为172 U/mL。LOX粗酶液稳定性较差，在4℃条件下活性可保持1周左右。

1.5 LOX酶活力的测定

底物制备：将0.25 mL Tween20分散于10 mL 0.2 mol/L pH 9.0硼酸盐缓冲液，摇动、逐滴加入0.27 mL亚油酸，充分混合，加入1.0 mL 1 mol/L NaOH溶液至澄清，调pH 9.0，缓冲液稀释至500 mL作为底物液。

酶活力测定[10]：取0.5 mL粗酶液移入2 mL底物液中，混匀，25℃水浴3 min，加5 mL无水乙醇终止反应，再加入5 mL蒸馏水，6 000 r/min离心5 min，上清液于234 nm测吸光度；空白样为0.5 mL酶液中加5 mL无水乙醇、2 mL底物溶液，25℃恒温3 min，再加入5 mL蒸馏水。

酶活力定义：25℃、pH 9.0，以亚油酸为底物的3 mL反应体系，234 nm每分钟增加0.001吸光度值定义为一个酶活力单位。

1.6 葵花籽油水解液的制备

称取葵花籽油20 g置于500 mL皂化瓶中，加入250 mL 0.5 mol/L KOH-乙醇溶液，90℃水浴回流l h，皂化、冷却，皂化液浓H2SO4酸化至pH 3.0，1 000 mL分液漏斗，并加入少量饱和NaCl静置，上层油相即为葵花籽油水解液（混合脂肪酸）[11]。

1.7 风味化合物的提取及浓缩

正戊烷为溶剂萃取香菇匀浆中风味化合物。香菇匀浆温度冷却至室温，加入20 mL正戊烷，5 000 r/min离心10 min，上清液加入NaCl除去蛋白，5 000 r/min离心5 min，加入适量经新鲜干燥 （500℃，4 h）的无水 Na2SO4，5 000 r/min 离心 5 min，得上清提取液，旋转蒸发仪40℃浓缩至体积为2 mL，N2吹去溶剂，浓缩至1 mL，GC-MS检测分析。

1.8 香菇风味成分的强化

称取洗净新鲜蘑菇，按质量比1∶1加入pH缓冲液，0.4%（以香菇质量计，下同）葵花籽油水解液和一定量大豆LOX粗酶液，捣碎匀浆，匀浆并转移至1 L保温装置中，进行风味强化。研究pH、温度、时间、通氧速率、搅拌速度、粗酶液添加量等因素条件对香菇风味成分的产生的影响，优化工艺条件。

1.9 香菇风味成分检测

以邻二氯苯为内标，利用GC-MS检测以1-辛烯-3-醇、3-辛酮、1-辛醇、2-辛烯-1-醇为代表的风味化合物的质量分数。

TR-50MS石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：35 ℃保持 5 min，10 ℃/min升至 85℃，保持1 min，4℃/min升至 200℃，保持 3 min，10 ℃/min升至 230 ℃，保持 1 min；载气（He）流速 1.0 mL/min，压力 2.4 kPa，进样量 1.0 μL；分流比25∶1。

质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；传输线温度250℃；离子源温度220℃；质量扫描范围 m/z 45～500。

2 结果与分析

2.1 鲜香菇的风味成分分析

经SDE装置抽提、GC-MS分析，鲜香菇中共分离鉴定出风味化合物32种（总离子流图见图2），主要是含硫化合物、醇类、醛类、酯类、酮类、呋喃类、烃类等。其中，鲜香菇中八碳化合物占挥发成分的44.13%、含硫化合物为21.53%、酯类化合物为7.60%。

八碳化合物是鲜香菇主要风味物质。其中1-辛烯-3-醇 （占 23.07%）、1-辛醇 （2.30%）、3-辛醇（11.43%）、2-辛烯-1-醇 （2.29%）、2-乙基-1-己醇（1.84%）、5-甲基-3-庚醇（0.03%）、3-辛酮（3.17%）等，尤其以1-辛烯-3-醇对鲜香菇风味的贡献为最大。鲜香菇中八碳化合物占44.13%，而干香菇中质量分数为10.28%，因为八碳化合物挥发性较强，稳定性不高，干制过程中损失严重。

含硫化合物也是香菇的另一类重要风味组分。鲜香菇中鉴定出13种含硫化合物，主要是硫醚、含硫杂环两大类。主要包括：1，2，4-三硫杂环戊烷、1，3，5-三硫杂环己烷、1，2，4，5-四硫杂环戊烷、1，2，4，6-四硫杂环庚烷、1，2，3，5，6-五硫杂环庚烷、1，3，5，7，9-五硫杂环癸烷、3，5-二甲基-1，2，4-三硫杂环戊烷等，占挥发性成分的8.9%。其中，1，2，3，5，6-五 硫 杂 环 庚 烷 （ 俗 称 “ 香 菇 精 ”，Lenthionine）被认为是香菇最重要的风味化合物，赋予了香菇特征风味，在鲜香菇挥发性成分中约占0.47%，它在水溶液中阈值为0.27~0.53 mg/kg；1，2，4-三硫杂环戊烷是鲜香菇中含量最丰富的一种含硫化合物，质量分数约为2.24%，该化合物有强烈大蒜味，也是香菇的重要呈味物质，通常能影响菇体的主体香味。上述含硫化合物主要是由前体物质--香菇酸在谷氨酸转肽酶作用下产生二硫杂环丙烷中间体聚合而成的[12]；含硫化合物含量的差异也导致了干香菇风味特征更加浓郁，而鲜香菇则风味清淡。

在鲜香菇中检测出较高含量的硫醚类，如二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、甲基（甲硫基）甲基二硫醚、双（1-（甲硫基）乙基）二硫醚、甲基戊基二硫醚等，占鲜香菇挥发性成分的16.65%。二甲基二硫醚和二甲基三硫醚具有洋葱的气味，它们是1，2，3，5，6-五硫杂环庚烷的裂解产物。

图2 鲜香菇挥发性香气成分GC-MS总离子流图谱Fig.2 GC-MS Total ion chromatogram of volatile aroma components in extract of fresh Lentinus edodes

2.2 大豆LOX粗酶液促进香菇风味生成效果的初探

Wurzenberger报道，挥发性八碳化合物的前体主要是16~22碳的不饱和脂肪酸，尤以亚油酸、亚麻酸为主。不饱和脂肪酸在O2存在的条件下，经菇类自身的脂肪氧合酶、氢过氧化物裂解酶的连续作用形成八碳化合物，这类化合物风味阈值较低，因此提供了浓郁的蘑菇风味。1-辛烯-3-醇又称“蘑菇醇”，广泛存在于各种类蘑菇中，呈现出略带金属味的蘑菇特征性风味。1-辛烯-3-醇在鲜香菇中含量为23.07%，而在干香菇中仅为4.77%，导致了香菇干品与鲜品在风味上明显不同，未经加工的鲜香菇具有特征的蘑菇泥土香味，而香菇干品的特征蘑菇风味则较为淡薄。

根据上述鲜香菇风味成分的分析结果，选取1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）、3-辛酮（3-octenone）、1-辛醇（1-octanol）、2-辛烯-1-醇（2-octen-1-ol）等作为香菇风味基料提升效果的考察指标，添加一定量的葵花籽油水解液，以增加不饱和脂肪酸的来源，进行后续的试验研究。在温度30℃、保温时间30 min、通入氧气、搅拌的条件下，处理（1）香菇打浆液；（2）香菇打浆液+0.4%葵花籽油混合脂肪酸；（3）香菇打浆液+0.4%葵花籽油混合脂肪酸+0.5%LOX粗酶液的效果，对比各条件下风味化合物的生成量。表1结果显示，处理（3）香菇打浆液+0.4%葵花籽油混合脂肪酸+0.5%LOX粗酶液的风味化合物生成量显著增加，香菇风味显著增强。

表1 大豆LOX对香菇风味化合物的影响Table 1 Influence of soybean lipoxygenase on the formation of Lentinus edodes flavor （μg/hg）

2.3 因素条件对酶促强化香菇基料风味成分效果的影响

2.3.1 反应体系的pH对酶促强化效果的影响 在温度30℃、保温时间30 min、搅拌速度为1 000 r/min、通氧速率50 mL/min、质量分数0.5%LOX粗酶液、0.4%葵花籽油混合脂肪酸条件下，研究pH 4.0~9.0体系中pH对酶促强化风味成分效果的影响。图3结果表明，在体系pH 5.0时，香菇基料中1-辛烯-3-醇、3-辛酮、1-辛醇、2-辛烯-1-醇的生成量均达到最大，体系的pH过低或过高都将影响相关风味酶的活力，从而影响风味物质的生成，因此LOX强化香菇风味的最佳体系为pH 5.0。这与双孢蘑菇+亚油酸为底物时，1-辛烯-3-醇生成的最佳pH 6.0～7.0明显不同。

图3 pH对香菇风味化合物生成的影响Fig.3 Effect of pH on the formation of Lentinus edodes flavor

2.3.2 温度对酶促强化效果的影响 在反应体系pH 7.0、保温时间30 min、搅拌速度为1 000 r/min、通氧速率50 mL/min、质量分数0.5%LOX粗酶液、0.4%葵花籽油混合脂肪酸条件下，20~60℃时，温度对酶促强化效果的影响。温度对酶促反应有一定影响（图4），在25~40℃范围内，各风味化合物生成量基本保持相当水平；温度40℃时，产物中1-辛烯-3-醇、2-辛烯-1-醇、1-辛醇出现峰值；体系温度≥30℃时，3-辛酮生成量明显下降；温度≥40℃，各风味成分呈现下降趋势，其原因可能是随着温度的提高，上述风味成分的挥发速度加快或产生分解变化。考虑较高的温度容易导致风味成分的流失，因此认为40℃是酶促反应强化风味的适宜温度。

2.3.3 保温时间对酶促强化效果的影响 在体系pH 7.0、温度30℃、搅拌速度为1 000 r/min、通氧速率50 mL/min、质量分数0.5%LOX粗酶液、0.4%葵花籽油混合脂肪酸条件下，考察60 min内香菇风味成分酶促变化。各风味化合物生成量随着时间延长而增加（图 5），且于 40 min时 1-辛烯-3-醇、2-辛烯-1-醇、3-辛酮生成量均出现峰值，随后各风味化合物逐渐减少。说明LOX催化的亚油酸氧化成氢过氧化物不稳定，易变性，随着反应时间的延长，香菇中多酚氧化酶的活性增强，导致香菇浆液发生褐变。因此认为强化时间以40 min为宜。

图4 温度对香菇风味化合物生成的影响Fig.4 Effect of temperature on the formation of Lentinus edodes flavor

图5 保温时间对香菇风味化合物生成的影响Fig.5 Effect of incubation time on the formation of Lentinus edodes flavor

2.3.4 搅拌速度对酶促强化效果的影响 在体系pH 7.0、温度 30℃、时间 30 min、通氧速率 50 mL/min、质量分数0.5%LOX粗酶液、0.4%葵花籽油混合脂肪酸条件下，研究搅拌速度对香菇风味化合物生成量的影响。图6搅拌速度250~1 500 r/min时风味强化的效果，表明搅拌速度对各风味化合物生成量的影响较小。

图6 搅拌速度对香菇风味化合物生成的影响Fig.6 Effect of stirring speed on the formation of Lentinus edodes flavor

2.3.5 通氧速率对酶促强化效果的影响 LOX酶促反应生成八碳化合物是一个加氧过程，需要氧气参与。在体系pH 7.0、温度30℃、时间30 min、搅拌速度1 000 r/min、质量分数0.5%LOX粗酶液、0.4%葵花籽油混合脂肪酸的条件下，研究通氧速率对酶促强化效果的影响。图7所示，在50~250 mL/min通氧速率范围，通氧速率对试验结果的影响不显著，这与Martini研究利用大豆LOX催化生成13-HPOD的结论基本一致，即50 mL/min较低氧气水平对酶促强化是足够的。

图7 通氧速率对香菇风味化合物生成的影响Fig.7 Effect of oxygen rate on the formation of Lentinus edodes flavor

2.3.6 大豆LOX粗酶液添加量对酶促强化效果的影响 在体系pH 7.0、温度30℃、保温时间30 min、搅拌速度 1 000 r/min、通氧速率 50 mL/min、质量分数0.4%葵花籽油混合脂肪酸条件下，考察粗酶液添加量为0.1%~0.9%时，各风味化合物生成量与大豆LOX粗酶液添加量的相关性（图8）。随着LOX粗酶液添加量的增加，各风味化合物的生成量均呈现不同程度的增加，蘑菇风味强度增大，添加量达到0.5%时，各风味成分的增加幅度趋缓，因此选择大豆LOX粗酶液添加量为0.5%。

图8 大豆LOX粗酶液用量对香菇风味成分生成的影响Fig.8 Effect of the amount of LOX crude extract on the formation of Lentinus edodes flavor

3 结语

经SDE装置抽提、GC-MS分析，鲜香菇中共分离鉴定出风味化合物32种，主要是含硫化合物、醇类、醛类、酯类、酮类、呋喃类、烃类等，其中八碳化合物占鲜香菇总挥发成分的44.13%、含硫化合物为21.53%、酯类化合物为7.60%。八碳化合物中1-辛烯-3-醇、1-辛醇、3-辛酮、2-辛烯-1-醇等，1，2，3，5，6-五硫杂环庚烷、1，2，4-三硫杂环戊烷等是鲜香菇主要风味物质。体系的pH、温度、搅拌速度、通氧速率等因素条件对大豆脂肪氧合酶强化香菇风味基料风味成分的产生有一定影响，试验确定酶促强化风味条件为：质量分数0.5%LOX酶粗酶液添加量、0.4%葵花籽油水解液、pH 5.0、温度40℃、搅拌速度500 r/min、通氧速率 50 mL/min、保温时间40 min。

[1]陈海强，胡汝晓，彭运祥，等.食用菌鲜味物质研究进展[J].现代生物医学进展，2011，11（19）：3783-3786.CHEN Haiqiang，HU Ruxiao，PENG Yunxian，et al.Research advancements of umami substance in edible fungus[J].Progess in Modern Biomedicine，2011，11（19）：3783-3786.（in Chinese）

[2]芮汉明，贺丰霞，郭凯.香菇干燥过程中挥发性成分的研究[J].食品科学，2009，30（8）：255-259.RUI Hanming，HE Fengxia，GUO Kai.Analysis of volatile components in lentinus edodes during drying process[J].Food Science，2009，30（8）：255-259.（in Chinese）

[3]安晶晶，王成涛，刘国荣，等.鲜香菇与干香菇挥发性风味成分的GC-MS分析[J].食品工业科技，2012，33（14）：68-71.AN Jingjing，WANG Chengtao，LIU Guorong，et al.Analysis of volatile aroma components of fresh and dry Lentinus edodes with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）[J].Science and Technology of Food Industry，2012，33 （14）：68-71.（in Chinese）

[4]安晶晶，王成涛，张小溪，等.5'-磷酸二酯酶强化香菇风味基料中鲜味成分[J].北京工商大学学报：自然科学版，2012，30（3）：35-38.AN Jingjing，WANG Chengtao，ZHANG Xiaoxi，et al.Preparation of mushrooms flavor ingredients by 5′-phosphodiesterase[J].Journal of Beijing Technology and Business University：Natural Science Edition，2012，30（3）：35-38.（in Chinese）

[5]张书香，谢建春，孙宝国.固相微萃取/气-质联用分析香菇挥发性香味成分[J].北京工商大学学报：自然科学版，2010，28（2）：1-5.ZHANG Shuxiang，XIE Jianchun，SUN Baoguo.Analysis of volatile flavor in lentinus edodes by solid-phase micro-extraction combining with GC-MS[J].Journal of Beijing Technology and Business University：Natural Science Edition，2010，28（2）：1-5.（in Chinese）

[6]李秦，海洋，师会勤，等.平菇与香菇挥发性香气成分的GC-MS分析比较[J].化学与生物工程，2010，27（2）：87-89.LI Qin，HAI Yang，SHI Huiqing，et al.Analysis of volatile aroma components of pleurotus ostreatus and edodes with gas chromatography-mass spectrometry[J].Chemistry&Bioengineering，2010，27（2）：87-89.（in Chinese）

[7]陈书婷，孔祥珍，华欲飞，等.大豆脂肪氧合酶的分离纯化及其性质研究[J].食品工业科技，2011，32（5）：176-182.CHEN Shuting，KONG Xiangzhen，HUA Yufei，et al.Study on purification and some properties of soybean lipoxygenase[J].Science and Technology of Food Industry，2011，32（5）：176-182.（in Chinese）

[8]田其英，华欲飞.大豆脂肪氧合酶研究进展[J].粮食与油脂，2006（8）：6-9.TIAN Qiying，HUA Yufei.Research advance on soybean lipoxygenase[J].Cereals&Oils，2006（8）：6-9.（in Chinese）

[9]WANG Hui，ZHOU Peigen.Study on purification and some properties of soybean lipoxygenase[J].Food Science，2008，29（9）：396-398.

[10]蔡琨，方云，夏咏梅，等.大豆脂肪氧合酶的提取及影响酶活因素的研究[J].林产化学与工业，2004，24（2）：52-56.CAI Kun，FANG Yun，XIA Yongmei，et al.Extraction of soybean lipoxygenase and factors affecting its enzyme activity[J].Chemistry and Industry of Forest Products，2004，24（2）：52-56.（in Chinese）

[11]周建红，令玉林，李会东，等.双孢蘑菇风味强化与胶囊化研究[J].中国食品学报，2005，5（4）：106-110.ZHOU Jianhong，LING Yuling，LI Huidong，et al.The enhacement and encapsulation of agaricus bisporus flavor[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2005，5（4）：106-110.（in Chinese）

[12]Hiraide M，Kato A，Nakashima T.The smell and odorous components of dried shiitake mushroom，Lentinula edodes V：changes in lenthionine and lenthinic acid contents during the drying process[J].Jounal of Wood Science，2010，56（6）：477-482.