油菜蜂花粉中核苷类成分的分离及鉴定

段元锋， 吴盼盼， 徐德平

（江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

油菜（Brassica campestris L.）是十字花科芸薹属植物，原产中国，颜色深绿，帮如白菜，为中国大面积种植的农业经济作物。油菜蜂花粉 （Rape Bee Pollen）是蜜蜂采集油菜的花粉，再经蜜蜂加工而成的花粉团状物，蜜蜂在采集花粉的过程中加入了一些分泌物[1-4]。蜂花粉内含有许多的生物活性物质如酚类、类黄酮、脂类、蛋白质、维生素、微量元素等，被人们认为是天然的健康食品，因此有“浓缩的营养库”之称，具有抗氧化和清除自由基、抗衰老、提高免疫力等功效[5-7]。

油菜蜂花粉中功能性成分的研究已有大量文献报道，但油菜蜂花粉中的核苷类物质研究少见报道。核苷类成分是生物细胞维持生命的重要物质，具有免疫调节、改善脑细胞代谢以及调节中枢神经等多种生理活性，人们现已研究开发了多种核苷类产品[8-10]。黄兰等人对油菜蜂花粉中一种化合物，通过TLC薄层色谱法、LC-Q-TOF测定与腺嘌呤标品比对等辅助方法，确定化合物为腺嘌呤，并未直接分离并进行结构解析[11]。作者首次从油菜蜂花粉中直接分离出3种核苷类成分并对其化学结构进行鉴定，为油菜蜂花粉中核苷类物质的活性及生理作用等各方面的研究提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油菜蜂花粉：购自青海门源蜂场；ODS柱填料：Nacalai Tosoh Inc产品；AB-8型大孔吸附树脂：天津南开大学化学工厂产品；GF254硅胶板：山东烟台芝罘化工厂产品；无水乙醇、甲醇、正丁醇、冰醋酸、硫酸、茴香醛、氯仿：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品。

1.2 仪器与设备

WFJ8-20中药粉碎机：江阴市灵杏药化设备有限公司产品；CQ-005萃取罐：常州市特威电气自动化系统有限公司产品；R-1002旋转蒸发器：上海申顺生物科技有限公司产品；BS-100A自动部份收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司产品；ZF-90暗箱式紫外透射仪：上海顾村电光仪器厂产品；Avance-500核磁共振仪 ：瑞士Bruker公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 油菜蜂花粉水溶性成分的提取 称取油菜蜂花粉10 kg，粉碎后过40目筛，置于100 L萃取罐中，按1 g∶5 mL料液质量体积比加入去离子水，60℃条件下搅拌提取3 h，过滤取滤液，渣在同样条件下，重复提取一次，合并滤液，减压浓缩成浸膏保存。

1.3.2 油菜蜂花粉水溶性成分的粗分离 取浸膏加适量去离子水超声条件下溶解，上大孔树脂AB-8 柱（10 cm×150 cm），流量 20 mL/min，依次用去离子水，体积分数20%、95%乙醇溶液进行洗脱，洗出液500 mL/段，分步收集，合并体积分数20%乙醇洗脱溶液，减压浓缩至无乙醇，得体积分数20%乙醇洗脱物。

1.3.3 乙醇洗脱物分离 将体积分数20%乙醇洗脱物上MCI-GEL柱（5 cm×150 cm），分别用去离子水，体积分数5%、15%、25%乙醇溶液进行洗脱，自动收集器15mL/管收集洗脱液，采用TLC薄层法检测，根据Rf值将洗脱液粗分为A，B，C等3部分，各部分分别减压浓缩保存。

1.3.4 纯化 将3部分分别上ODS-B（3 cm×100 cm）色谱柱，用乙醇溶剂梯度洗脱，流量10 mL/min，自动收集器15mL/管收集洗脱液，TLC薄层法跟踪检测洗脱液，将Rf值和显色反应一致的洗脱液合并减压浓缩，反复上 ODS-B（3 cm×100 cm）色谱柱，直至得 3个纯化合物，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

1.3.5 纯度鉴定 将色谱分离的纯的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，通过薄层层析法（TLC）进行纯度鉴定。展开剂为正丁醇-水-冰醋酸（体积比 5∶4∶3）溶液，显色剂为甲醇-冰醋酸-浓硫酸-茴香醛（体积比 17∶2∶1∶0.1）溶液。

1.3.6 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个化合物结构鉴定 对得到的化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ以氘代吡啶为溶剂，四甲基硅烷（TMS）为 内 标物 ， 通 过1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR进行分析。经1H-NMR、13C-NMR和135DEPT-NMR等方法鉴定其化学结构。

2 结果与讨论

2.1 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的纯度

如图1显示，由TLC薄层检测化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在薄层板上均为单一斑点，表明分离后得到的化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的纯度已达到核磁分析的要求。

图1 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的薄层色谱图Fig.1 Thin layer chromatographic spectrum of componentⅠ、Ⅱ、Ⅲ

2.2NMR分析

2.2.1 化合物Ⅰ 白色无定形粉末，可溶解于水、含水甲醇、乙醇中。从化合物Ⅰ的1H-NMR图谱可见，δ10.65，7.94各有1个单峰H信号，这二个H应为活泼H，6.46有1个单峰H2信号，表明这二个H是N上H，δ5.70有1个双峰质子信号，J值为6.0，可能为糖的端基H信号，其余H信号为糖上H信号，推测该化合物含有1个糖基。13C-NMR（125 MHz）中可见到 10 个碳信号（见表 1），δ 95~110 处未见到糖的端基碳信号，δ 61~87有5个碳信号，推测该化合物含有1个五碳糖，δ 86.4应为与N相连的端基碳，经与文献相比较得出为核糖。δ 110~160处见到5个碳信号，135DEPT中可见只有1个CH信号，其余4个为季碳，参照文献可得这5个碳信号与鸟嘌呤一致。通过以上分析和文献比较，确定化合物Ⅰ为鸟嘌呤核苷。

2.2.2 化合物Ⅱ 白色无定形粉末，可溶解于水，含水甲醇、乙醇中。从化合物Ⅱ的1H-NMR图谱可见，δ8.37，8.16各有1个单峰H信号，这二个H应为活泼H，7.35有1个单峰H2信号，提示这二个H是N上H，δ5.90有1个双峰质子信号，J值为6.0，可能为糖的端基H信号，其余H信号为糖上H信号，推测该化合物含有1个糖基。13C-NMR（125 MHz）中可见到 10 个碳信号（见表 1），δ 95~110 处未见到糖的端基碳信号，δ 61~87有5个碳信号，推测该化合物含有1个五碳糖，δ 86.4应为与N相连的端基碳，经与文献相比较得出为核糖。δ 110~160处见到5个碳信号，135DEPT中可见只有2个CH信号，其余4个为季碳，参照文献可得这5个碳信号与腺嘌呤一致。通过以上分析和文献比较，确定化合物Ⅱ为腺嘌呤核苷。

2.2.3 化合物Ⅲ 白色无定形粉末，可溶解于水，含水甲醇和乙醇中。从化合物Ⅲ的1H-NMR图谱可见，δ 13.22有1个单峰H信号，应为活泼H；δ 5.11有1个双峰质子信号，J值为6.4，可能为糖的端基H信号，δ 1.95有一个单峰甲基，δ 5.11其余H信号为糖上H信号，推测该化合物含有1个糖基。13CNMR（125 MHz）（见表 1）中可见到 10 个碳信号，δ 95~110处未见到糖的端基碳信号，δ 89.0应为与N相连的端基碳，δ 61~87有4个碳信号，δ 41.5有一个CH2信号，推测该化合物含有1个脱氧五碳糖，经与文献相比较得出为2-脱氧核糖。δ 110~160处见到4个碳信号，135DEPT中可见只有1个CH信号，其余3个为季碳，δ 12.9有一个甲基碳信号，参照文献可得这5个碳信号与胞腺嘧啶一致。通过以上分析和文献比较，确定化合物Ⅲ为胞腺嘧啶脱氧核苷。

表1 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在13C-NMR中的碳信号Table 1 Signals of carbon in the13C-NMR of CompoundⅠ，Ⅱ andⅢ

3 结语

油菜蜂花粉的水提物，经过AB-8柱粗分离，再经MCI-GEL柱，ODS-B色谱柱分离纯化，得到3种化合物，最后通过核磁共振分析，3种化合物分别为：鸟嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、胞腺嘧啶脱氧核苷。3种化合物均为首次从油菜蜂花粉中直接分离纯化并进行结构分析的核苷类物质，其中的鸟嘌呤核苷、胞腺嘧啶脱氧核苷在油菜蜂花粉中首次报道。

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