亳菊啤酒抗氧化性研究

燕傲蕾，葛永斌，郭 慧

亳州师范高等专科学校理化系，安徽亳州，236800

自由基是生物代谢过程中出现的中间产物，过量自由基会攻击生物分子不饱和位点，损伤DNA、蛋白质等有机分子，引起细胞代谢紊乱。在现代快节奏的生活方式和日光、紫外线、电离辐射等外部不良条件的影响下，人体产生的自由基及其诱导的氧化反应已成为加速细胞衰老、引发多种疾病的重要因素［1］，机体抗氧化能力的强弱与其健康程度密切相关，食品抗氧化能力的强弱也成为评价其保健能力的重要指标［2］。

啤酒是广受大众喜爱的休闲饮品，含有800多种有机、无机化合物，具有一定的抗氧化功能和营养价值［3］。亳菊啤酒兼具啤酒独特风味和菊花清新适口的特点，且由于亳菊所含的金合欢素、木犀草素等成分的融入，使啤酒具备了亳菊所具备的营养保健功能。研究亳菊啤酒的抗氧化性不仅对提高啤酒的风味稳定性有积极意义，而且对其营养价值和保健功能的评价也具有重要的参考价值［4］。由于亳菊啤酒中成分复杂，抗氧化物质众多，单独使用一种方法不能准确反映样品的总抗氧化活性［5］，因此，本实验采用TRAP、DPPH、ABTS和羟自由基清除四种方法对亳菊啤酒的体外抗氧化性进行研究，以综合评价其抗氧化能力，为亳菊啤酒的进一步研究和开发打下基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV759型紫外－可见分光光度计，购自上海精密科学仪器有限公司。

安徽亳州当年产的一级亳菊（Chrysanthemum morifolium（Ramat.）Tzvel CV.），购自亳州市中药材交易中心。1，1－二苯基－2－苦基苯肼（DPPH，1－diphenyl－2－picryl hydrazyl）、2，4，6－三（2－吡啶基）－1，3，5－三丫嗪（TPTZ，2，4，6－Tris（2－pyridyl）－s－triazine）、2，2＇联氨－双（3－乙基苯并噻唑琳－6－磺酸〉二胺盐（ABTS，2，2－Azinobis（3－ehtylbenzothiazolin－6－sulfnic Acid）Diammonium Salt）购自Sigma公司，其他化学试剂均为国产分析纯（AR）。

1.2 实验方法

1.2.1 亳菊啤酒生产工艺

在啤酒后酵前期加入亳菊水提液，使亳菊啤酒中亳菊的浓度分别为1、2、3、4、5mg／L（以亳菊干重计），并设一罐不加亳菊的普通啤酒作为对照，具体工艺流程参见葛永斌的方法［6］。

1.2.2 亳菊啤酒体外抗氧化性测定

铁还原／抗氧化能力（FRAP）法测定总还原力参照Benzie的方法［7］，并略有改动。按0.1mol／L醋酸缓冲试剂（pH3.6）∶10mmol／L TPTZ∶20mmol／L氯化铁＝10∶1∶1（体积比）的比例混合制成FRAP试剂，取稀释2倍后的亳菊啤酒0.1mL与3.9mL FRAP溶液混匀，37℃水浴10min后，在593nm处测定吸光值。以1.0mmol／L硫酸亚铁为标准品制作标准曲线，计算样品抗氧化活性（FRAP值）。

DPPH·清除实验在Gorinstenin的方法［8］上略作调整。将亳菊啤酒稀释5倍后，取0.3mL与2.7mL0.2mmol／L的 DPPH 乙醇溶液混匀，暗处反应30min后在517nm处进行吸光度A1的测定。以0.3mL无水乙醇与2.7mL0.2mmol／L的 DPPH乙醇溶液的混匀物为空白对照测定吸光度A0。

DPPH·清除率（%）＝［（A0－A1）／A0］×100%（1）式中，A0为空白组吸光值；A1为样品组吸光值。

ABTS＋·清除实验参照Re的方法［9］并稍作修改。将140mmol／L的过硫酸铜和7mmol／L的ABTS＋·溶液按11∶625的体积比充分混合后，避光反应12～16h制成ABTS＋·储备液，测定前用无水乙醇将储备液稀释，得到在734nm处吸光值为0.700±0.002的ABTS＋·工作液。取稀释5倍后的亳菊啤酒0.3mL与2.7mL ABTS＋·工作液充分混合，室温条件下反应10min，以0.3mL蒸馏水与ABTS＋·工作液的混匀液为空白，在734nm处测定吸光值。ABTS＋·清除率按式（1）进行计算。

羟自由基（·OH）清除实验参照恭菁华的方法［10］，并适当修改。取稀释2倍后的亳菊啤酒1 mL，加 8.8mmol／L H2O2、9mmol／L FeSO4、9 mmol／L水杨酸－乙醇溶液各1mL，混匀后静置30min，以蒸馏水为空白对照，在510nm处测定吸光度，·OH清除率的计算同式（1）。

1.3 数据处理

每组实验均设3个重复，并用Excel 2007和SPSS 17.0软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度亳菊啤酒的总抗氧化活性

在酸性条件下，TPTZ可以与Fe3＋形成复合物（Fe3＋－TPTZ），在 还 原 性 物 质 作 用 下，Fe3＋－TPTZ会被还原成Fe2＋，从而使溶液呈现为蓝色且在593nm处达到最大吸收，还原物质的含量与其吸光度间存在比例关系。FRAP法不仅原理明确、标准化程度高、操作便捷，而且能避免自由基类型不同所引起的差异，是反映样品总抗氧化活性的常用方法［11］。

不同浓度亳菊啤酒的总还原力如图1所示（不同的字母表示存在显著性差异，P＜0.05，下同），随着亳菊添加浓度的上升，亳菊啤酒的总还原力也在不断升高，亳菊浓度为1、2、3、4、5g／L的亳菊啤酒总还原力分别为对照组的1.35、1.87、2.19、2.51和2.75倍，且各组间均存在显著差异（P＜0.05）。可见，添加亳菊可以显著提高啤酒的总还原力。但是，增加亳菊所引起的总还原力的增幅却表现出先上升后下降的趋势。当亳菊添加浓度为2g／L时，增幅最大，比1g／L亳菊啤酒的总还原力高了20.54；当亳菊添加浓度为3、4g／L时，总还原力的增幅稳定在12左右；当亳菊添加浓度为5g／L时，亳菊啤酒的总还原力仅比4g／L组高了9.84。可见，当亳菊添加浓度较低时，增加亳菊浓度可以显著提高成品啤酒的总还原力，但随着添加浓度的上升，这种提升效果越来越弱。

图1 不同浓度亳菊啤酒的总还原力

2.2 不同浓度亳菊啤酒的DPPH·清除能力

DPPH法自1958年出现后，广泛用于食品和生物试样抗氧化能力的定量测定。该法主要是利用DPPH·中存在单电子，在醇溶液中能形成稳定的含氮自由基并呈典型紫色，在517nm处有强吸收的特点，当有自由基清除剂存在时，孤对电子配对，从而使溶液的紫色消退、吸收减弱，变化程度与其接受的电子数量成定量关系［12］。DPPH法可用分光光度计进行快速的定量分析，在体外检测抗氧化剂清除自由基方法中最为常见，可用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价［13］。

从图2可以看出，随着亳菊添加浓度的上升，亳菊啤酒对DPPH·的清除率也表现出上升的趋势，但上升幅度却在逐渐变缓，亳菊添加浓度为1、2、3、4、5g／L时，亳菊啤酒对DPPH·的清除率分别为对照组的1.58、2.00、2.38、2.53、2.70倍，各浓度间DPPH· 清除 率分别增 加 19.55%、13.97%、12.85%、5.03%、5.59%，且3g／L与4g／L、4g／L与5g／L亳菊啤酒的DPPH·的清除率在统计学上无显著差异（P＞0.05）。这表明在亳菊添加浓度低于4g／L时，增加亳菊的量可以显著提高产品对DPPH·的清除效果，但当添加浓度达到4g／L以上，继续提高亳菊浓度，对DPPH·清除的意义不大。

图2 不同亳菊啤酒的DPPH·清除能力

2.3 不同浓度亳菊啤酒的ABTS＋·清除能力

Miller等［14］在1993年发表了用ABTS法评价样品抗氧化活性的方法——ABTS在活性氧氧化下生成稳定的蓝绿色ABTS＋·，在734nm处具有最强吸收，当样品中存在抗氧化物时，ABTS＋·的产生会被抑制，溶液颜色变浅，吸光值减少，测定此处吸光度的变化，可以表明样品对ABTS＋·清除能力的强弱。该方法在测定食品和饮料类抗氧化活性中广泛使用［15］。

不同浓度亳菊啤酒的ABTS＋·清除能力如图3所示。亳菊啤酒的ABTS＋·清除率随着亳菊添加浓度的升高而上升，添加浓度为1、2、3、4、5g／L的亳菊啤酒对ABTS＋·的清除能力分别为对照组的1.12、1.28、1.43、1.54和1.63倍，且各组间均存在显著差异（P＜0.05）。同FRAP法测定的总还原力情况类似，增加亳菊所引起的ABTS＋·清除率的增幅表现出先上升后下降的趋势，当亳菊添加浓度为2g／L时，增幅最大，比1g／L组的清除率提高了3.50%，当亳菊添加浓度达到3、4、5g／L 时，ABTS＋·清除率分别比2、3、4g／L组高了2.29%、2.20%和2.07%。可见，当亳菊添加浓度达到4g／L以上，亳菊添加浓度的进一步提升对啤酒总还原力的影响变小。

图3 不同浓度亳菊啤酒的ABTS＋·清除能力

2.4 不同浓度亳菊啤酒的·OH清除能力

·OH是最活跃的活性分子，也是进攻性最强的化学物质之一，可通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内多种分子作用，导致生物体组织脂质过氧化，蛋白质解聚、聚合，核酸断裂，多糖解聚，破坏细胞膜的结构与功能，引发细胞凋亡、坏死和突变，并与肿瘤、辐射损伤等有关，是目前所知活性氧自由基中对生物体毒性最强、危害最大的类型［16－17］，清除·OH能力的强弱可作为评价食品保健功能的重要指标。

从表4可以看出，随着亳菊添加浓度的上升，亳菊啤酒对·OH的清除能力有了很大的提高，分别为对照组的1.60、2.16、2.47、2.82、3.10倍，且各组间均存在显著差异（P＜0.05），添加亳菊对提高啤酒·OH的清除具有显著的促进作用。亳菊添加浓度为1、2、3、4、5g／L的亳菊啤酒，对·OH 的清除率比对照组、1、2、3、4g／L 组分别高了13.96%、12.75%、7.23%、7.89%、6.56%，随着亳菊添加 浓度的上升，啤酒的·OH清除能力的增长速度在逐渐下降。

图4 不同浓度亳菊啤酒的·OH清除能力

3 结束语

通过以上研究可以看出，虽然用不同方法评价亳菊啤酒的抗氧化性存在一定的差异，但均反映出添加亳菊水提液制备亳菊啤酒能显著提高成品啤酒的抗氧化性，并对机体中危害最大的羟自由基清除效果良好。因此，从抗氧化角度来说，亳菊的添加为啤酒增加了保健功能。但同时也注意到，在亳菊添加浓度较低时，增加亳菊对提高成品啤酒抗氧化能力效果良好，但当亳菊浓度达到一定水平后，抗氧化能力的提升速度却逐渐下降，亳菊添加浓度在2～4 g／L最为适宜。这也与之前的研究［6］“能保证亳菊啤酒质量、风味、适口度并体现菊花清香的亳菊添加量”是基本相符的。

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