淫羊藿苷与金雀异黄酮骨保护作用的比较研究

成 魁，陈克明，葛宝丰，甄 平，马慧萍，高玉海

（兰州军区兰州总医院骨科研究所，甘肃兰州 730050）

骨质疏松症是一种全身性的代谢性骨病，以骨矿含量降低、骨组织微结构退化、破坏和骨骼脆性增加为特点［1］。骨质疏松症由峰值骨量和骨丢失两方面决定［2］。因此，既能提高峰值骨量，又能预防骨丢失的药物为抗骨质疏松之良药。金雀异黄酮是一种大豆异黄酮，与雌二醇的结构相似，是热门的潜在抗骨质疏松药物。淫羊藿苷是一种在淫羊藿中分离出的黄酮苷类化合物，被报道能通过刺激成骨细胞分化和抑制破骨细胞骨吸收预防骨量丢失［3］。在本课题组前期的研究中发现，淫羊藿苷比金雀异黄酮有更强的促进成骨分化和矿化的能力，淫羊藿苷比金雀异黄酮在8位碳上多一个异戊烯基［4］。因此，假想淫羊藿苷的抗骨质疏松能力比金雀异黄酮更强。为了研究此假说，本研究给予相同物质的量的金雀异黄酮和淫羊藿苷作用于幼龄大鼠和切除卵巢大鼠，比较其药效。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器 淫羊藿苷（纯度≥98%，陕西宝鸡辰光生物科技有限公司）；金雀异黄酮（纯度≥98%，陕西宝鸡辰光生物科技有限公司）；炔雌醇（纯度≥98%，美仑生物公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶 5b（TRACP5B）ELISA试剂盒（IDS公司，英国）；骨钙素（OC）ELISA试剂盒（IDS公司，英国），骨钙素ELISA试剂盒（延吉公司，中国）；Technovit@9100试剂盒（Heraeus Kulzer GmbH＆Co.KG公司，德国）。双能X射线骨密度仪（GE公司，美国）；AGIS万能材料试验机（岛津公司，日本）；锯式切片机（Leica公司，德国）；倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本）；酶标仪（BIP Tek公司，美国）。

1.2 实验大鼠造模、分组与给药 1月龄SD♀大鼠36只，SPF级，体质量（125±3）g；6月龄 SD♀大鼠60只，SPF级，体质量（235±5）g，由甘肃中医学院实验动物中心提供［合格证号：SCXK（甘）2004-0006-152］。

1月龄SD♀大鼠随机分为3组（n＝12）：淫羊藿苷组（ICA，ig，25 mg·kg-1·d-1）、金雀异黄酮组（GEN，ig，10 mg·kg-1·d-1）、对照组（CON）。

6月龄SD♀大鼠随机分为5组（n＝12）：假手术组（SHAM）、对照组（OVX）、淫羊藿苷组（ICA，ig，25 mg·kg-1·d-1）、金雀异黄酮组（GEN，ig，10 mg·kg-1·d-1）和炔雌醇组（E，ig，30μg·kg-1·d-1）。5组大鼠腹腔注射（ip）10%水合氯醛，剂量为3 ml·kg-1。假手术组大鼠行假手术切除卵巢周围少许脂肪组织，OVX组、ICA组、GEN组和E组大鼠均切除双侧卵巢。大鼠饲养于SPF级实验室，自由摄水和进食，记录每日进食量和进水量，每周称1次体重。

1.3 指标测定

1.3.1 骨密度的测定 实验开始后，每月在麻醉状态下测一次全身骨密度，第3个月测完后即处死所有动物，剥离出右侧股骨用于检测骨密度。

1.3.2 血清生化指标的测定 采用心脏取血法抽取血样，4 000 r·min-1，离心10 min，取上层血清，-80℃保存；按试剂盒说明书制作标准曲线，OC于450nm、TRACP 5b于405nm处测定OD值，通过标准曲线计算出含量。

1.3.3 骨形态计量分析 将右侧胫骨固定于80%乙醇中。严格按照Technovit@9100试剂盒操作说明书依次进行脱水、脱塑、浸渍、渗透和包埋，聚合2 d后切片、磨片，用VG法染色，观察骨骺线下1 mm至4 mm距离区域。

1.4 生物力学分析 将左侧股骨用浸透生理盐水的纱布包裹后，保存于-20℃。在实验前24 h取出，于室温下自然解冻。三点弯曲试验的跨距为17 mm，速度为10 mm·min-1。记录载荷变形曲线，得到包括最大载荷、屈服强度和弹性模量等指标；试验速度为10 mm·min-1。记录载荷变形曲线，得到包括最大载荷、屈服强度和弹性模量等指标。

1.5 统计学处理 统计分析均采用SPSS 16.0（SPSS公司，美国）软件完成，组间比较采用方差分析和LSD检验。

2 结果

2.1 体重检测结果 1月龄大鼠体重在实验后第3个月时，组间无差异。6月龄大鼠体重在实验后第3个月时，与OVX组相比，E组差异有显著性，见Tab 1。

Tab 1 Result of body weight of rats（±s，n＝12）

Tab 1 Result of body weight of rats（±s，n＝12）

6-mo-old rat，*P＜0.05 vs OVX

Group Body weight/g 1-mo-old CON 239.57±21.62 ICA 241.18±17.06 GEN 238.34±19.83 6-mo-old SHAM 242.65±20.33 OVX 259.11±24.17 ICA 274.45±45.11 GEN 279.97±16.28 E 214.16±23.19*

2.2 骨密度检测结果 1月龄大鼠口服淫羊藿苷3个月后，相比较CON组，其全身骨密度明显提高，而GEN组无明显变化（Fig 1）。同时，ICA组平均值高于GEN组（P＜0.05）。6月龄大鼠切除卵巢3个月后，与SHAM组比较，全身骨密度明显降低，表明骨质疏松模型建立。与OVX组比较，ICA组、GEN组和E组全身骨密度均明显升高（P＜0.05），而GEN组平均值高于ICA组。股骨骨密度结果与全身骨密度一致（Fig 2）。

2.3 血清OC和TRACP5b测定结果 1月龄大鼠口服淫羊藿苷后，与CON组相比，其血清OC水平明显升高（P＜0.05），而GEN组无明显变化。同时，ICA组平均值高于GEN组。6月龄大鼠切除卵巢后，与SHAM组比较，血清OC水平明显降低。与OVX组比较，GEN组血清OC水平明显升高（P＜0.05），而ICA组无明显变化，且GEN组平均值高于ICA组（Tab 2）。

Fig 1 Result of total bonem ineral densityThe total bonemineral density of1-mo-old ratswere enhanced by oral icariin.And its average was higher than genistein.The total bone mineral density of6-mo-old ratswere enhanced by oral icariin.However，its average was lower than genistein（1-mo-old rat，n＝12，*P＜0.05 vs CON，＃P＜0.05 vs GEN；6-mo-old rat，n＝12，*P＜0.05 vs SHAM；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs OVX）

1月龄大鼠口服淫羊藿苷后，与CON组相比，其血清TRACP5b水平明显降低（P＜0.05），而GEN组无明显变化。同时，ICA组平均值低于GEN组。6月龄大鼠切除卵巢后，与 SHAM组比较，血清TRACP5b水平明显升高（P＜0.01）。与OVX组比较，ICA组、GEN组血清TRACP5b水平明显降低（P＜0.01），且ICA组平均值低于GEN组（Tab 2）。

2.4 组织微结构结果 1月龄大鼠口服淫羊藿苷后，骨组织微结构更加优异，骨小梁数量和交联度都提高，金雀异黄酮组虽然也有改善，但效果劣于淫羊藿苷。6月龄大鼠切除卵巢后，骨组织微结构明显退化，红色网状结构减少，出现广阔空白区域。口服淫羊藿苷、金雀异黄酮后明显改善，且金雀异黄酮组优于淫羊藿苷组（Fig 3）。

Tab 2 Result of serum OC and TRACP5b concentration±s，n＝12）

Tab 2 Result of serum OC and TRACP5b concentration±s，n＝12）

1-mo-old rat，*P＜0.05 vs CON；6-mo-old rat，*P＜0.05，**P＜0.01 vs SHAM；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs OVX

G r o u p O C/μ g·L-1 T R A C P 5 b/U·L-1 1-m o-o l d C O N 6 9.9 4±1.3 8 0.6 9±0.1 5 I C A 7 1.0 3±1.1 7* 0.5 4±0.0 9*G E N 7 0.9 4±1.9 1 0.6 8±0.1 6 6-m o-o l d S H A M 1.4 1 2 9±0.0 0 0 3 0.4 8 8±0.0 1 O V X 1.4 1 2 3±0.0 0 0 7* 0.5 3 4±0.0 3**I C A 1.4 1 2 7±0.0 0 0 4 0.4 6 8±0.0 2＃＃G E N 1.4 1 2 9±0.0 0 0 1 0 3＃ 0.4 7 4±0.0 1 2＃＃E 1.4 1 2 8±0.0 0 0 1 1＃ 0.4 6 1±0.0 0 7＃＃

Fig 2 Result of femural bonem ineral densityThe femural bonemineral density of1-mo-old ratswere enhanced by oral icariin.And its averagewas higher than genistein.The femural bone mineral density of6-mo-old ratswere enhanced by oral icariin.However，its average was lower than genistein（1-mo-old rat，n＝12，**P＜0.01 vs CON，＃P＜0.05 vs GEN；6-mo-old rat，n＝12，**P＜0.01 vs SHAM，＃＃P＜0.01 vs OVX）

Fig 3 Bonem icroarchitectureBone trabeculae number and connection of1-mo-old ratswere best developed by oral icariin.However，Bone trabeculae number and connection of6-mo-old rats were best developed by oral genistein（n＝3）.

2.5 生物力学测定结果 如Fig 4所示，1月龄大鼠淫羊藿苷组与CON组相比，其最大载荷、弹性模量和屈服强度均提高（P＜0.05），金雀异黄酮组最大载荷和屈服强度均升高，弹性模量无统计学意义，同时，淫羊藿苷组最大载荷、弹性模量和屈服强度平均值均高于金雀异黄酮组。6月龄大鼠切除卵巢后，与SHAM组比较，最大载荷、弹性模量和屈服强度均降低（P＜0.01）。与OVX组比较，ICA组、GEN组最大载荷、弹性模量和屈服强度均升高（P＜0.05），而GEN组平均值均高于ICA组。

Fig 4 Result of femoral biomechanicsThe biomechanics of 1-mo-old rats were enhanced by oral icariin.And its average was higher than genistein.The biomechanics of6-mo-old rats were enhanced by oral icariin.However，its average was lower than genistein（1-mo-old rats，n＝12，*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON；6-mo-old rats，n＝12，**P＜0.01 vs SHAM，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs OVX）

3 讨论

骨质疏松侵扰亿万人的健康，强健的骨是晚年优质生活的必要，它与在青少年时获得的峰值骨量相关，高峰值骨量减缓罹患骨质疏松的风险［5］。同时，绝经期能通过药物补充雌激素，抑制骨丢失，预防骨质疏松，但雌激素替代疗法出现患癌等严重副作用。金雀异黄酮临危受命，近年来备受瞩目，作为植物雌激素有望成为临床抗骨质疏松药物，实验大鼠常用剂量 10 mg·kg-1·d-1［6］。如果能寻找一种比金雀异黄酮药效更强的植物雌激素或者雌激素样作用的化合物，将为临床提供更多选择。淫羊藿苷是中医常用壮骨药物淫羊藿的提取物，有报道淫羊藿苷可预防绝经后大鼠骨丢失［7］。本实验淫羊藿苷和金雀异黄酮采用相同物质的量的剂量，影响两种不同年龄大鼠的骨量，研究防治骨质疏松的效果。

1月龄大鼠灌服淫羊藿苷后，骨密度、骨组织微结构和生物力学均提高，且其平均值均高于金雀异黄酮组。骨钙素是成骨细胞特异性分泌的因子，淫羊藿苷提高血清骨钙素含量的能力比金雀异黄酮更高。较强的骨密度、骨微结构和力学性能得益于淫羊藿苷更强的成骨性分化能力。换言之，淫羊藿苷提高峰值骨量的能力强于金雀异黄酮。然而，6月龄大鼠灌服淫羊藿苷后，骨密度、骨组织微结构和生物力学虽均提高，但其平均值均低于金雀异黄酮组。同时，金雀异黄酮明显提高骨钙素，而淫羊藿苷无此效果。意味着金雀异黄酮抑制绝经后骨量丢失的能力强于淫羊藿苷。综上，淫羊藿苷相比较金雀异黄酮，在大鼠两种不同的生理状态表现出不同的药理活性，峰值骨量在青春期获得处于生长阶段，促进成骨性分化和矿化，有利于骨生长和骨量积累［8］。而切除卵巢后，体内环境受制于雌激素，雌激素水平左右骨量，植物雌激素金雀异黄酮相比淫羊藿苷发挥更强的雌激素作用，预防骨量丢失。

通过研究淫羊藿苷和金雀异黄酮对两种模型大鼠骨量的影响，发现淫羊藿苷提高峰值骨量的活性强，金雀异黄酮抑制绝经后骨量丢失的活性强。即淫羊藿苷有更强的成骨活性，而金雀异黄酮有更强的雌激素活性。这种不同的雌激素和成骨活性的机制有待进一步研究。

参考文献：

［1］ Okano T.Effects of essential trace elements on bone turnover-in relation to the osteoporosis［J］.Nihon Rinsho，1996，54（1）：148-54.

［2］ 安 珍，程 静，王文志，等.峰值骨量与骨质疏松症 ［J］.现代康复，2001，5（2）：152-4.

［2］ An J，Cheng J，WangW Z，et al.Peak boneount and osteoporosis［J］.Mod Rehabil，2001，5（2）：152-4.

［3］ Hsieh T P，Sheu SY，Sun JS，etal.Icariin isolated from Epimedium pubescens regulates osteoblasts anabolism through BMP-2，SMAD4，and Cbfa1 expression［J］.Phytomedicine，2010，17（6）：414-23.

［4］ Ma H P，Ming L G，Song P，et al.Icariin is more potent than genistein in promoting osteoblast differentiation and mineralization in vitro［J］.JCell Biochem，2011，112（3）：916-23.

［5］ Kaludjerovic J，Ward W E.Neonatal exposure to daidzein，genistein，or the combination modulates bone development in female CD-1 mice［J］.JNutrition，2009，139（3）：467-73.

［6］ Picherit C，Coxam V，Bennetau-Pelissero C，et al.Daidzein is more efficient than genistein in preventing ovariectomy-induced bone loss in rats［J］.JNutrition，2000，130（7）：1675-81.

［7］ Bao J，Yang J，LiS，etal.Effectsof Icariin on ovariectomized osteoporotic rats［J］.JHygiene Res，2005，34（2）：191.

［8］ Mardon J，Mathey J，Kati-Coulibaly S，et al.Influence of lifelong soy isoflavones consumption on bonemass in the rat［J］.Exp Biol Med，2008，233（2）：229-37.