异丙肾上腺素致小鼠心肌纤维化模型的制备及评价

陈 蓉，谢梅林

（1.苏州大学附属第一医院药学部，江苏苏州 215006；2.苏州大学医学部药理系，江苏苏州 215123）

心肌纤维化是多种心血管系统疾病终末期的共同病理表现，有效地抑制和逆转心肌纤维化、心室重塑是目前临床防止心力衰竭、心律失常及心源性猝死等严重不良事件的主要策略［1］，其形成机制复杂，涉及肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）及多种细胞因子，是心血管研究领域的重点、难点课题之一。因此，建立一种简单、经济、可靠的心肌纤维化动物模型对于心肌纤维化的研究有着重要意义。

目前，实验性动物心肌纤维化的造模方法有：①自发性高血压大鼠（SHR）心肌纤维化［2］；② 糖尿病大鼠心肌纤维化［3］；③ 结扎腹主动脉或单侧肾动脉致心肌纤维化［4］；④冠脉结扎法等引起心肌梗死心肌纤维化［5］；⑤异丙肾上腺素诱导心肌缺血损伤心肌纤维化［6］；⑥病毒感染致病毒性心肌病［7］。其中，异丙肾上腺素皮下注射诱导的心肌纤维化模型优势在于方法简单，无创且接近自然病程。大鼠皮下注射异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化文献较多，小鼠相关的文献较少，且异丙肾上腺素的给药剂量、给药间隔报道不一致［8］。本实验对异丙肾上腺素的给药剂量、给药间隔进行了摸索，成功建立了小鼠的心肌纤维化模型。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级昆明种♂小鼠，22～25 g，由苏州大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证：SCXK（苏）2007-0007；实验动物使用许可证：SYXK（苏）2007-0035。实验处置符合动物伦理学标准。

1.2 仪器与药物 倒置显微镜XDS-1B型（重庆光学仪器厂）；722型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；DS-671电子秤（上海寺冈电子有限公司）；80-2型台式低速离心机（上海医疗器械集团有限公司）；PK-S22电热恒温水浴锅（上海精宏仪器设备有限公司）；MR23i高速冷冻离心机（法国Jouan公司）；MyCycler TM型 PCR仪（美国 Bio-rad公司）。异丙肾上腺素购自上海禾丰制药有限公司；Hydro试剂盒购自南京建成生物公司；CollagenⅠ引物购自上海生工科技公司。其余试剂为分析纯。

1.3 模型制备 将昆明种小鼠随机分为心肌纤维化模型组和溶媒对照组，每组10只。模型组小鼠皮下注射5 mg·kg-1异丙肾上腺素1 d后，以2.5 mg·kg-1维持至30 d。溶媒对照组同法皮下注射等量的生理盐水。

1.4 心重指数（cardiac weight index，CW I）测定 末次注射异丙肾上腺素（对照组注射生理盐水）后次日，2组小鼠称重，颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠心脏，称重，计算CWI。CWI（mg/g）＝全心重/体重。

1.5 小鼠心肌中羟脯氨酸（hydroxyproline，Hydro）含量测定 采用消化法检测小鼠心肌中Hydro含量，组织中的胶原经酶消化产生Hydro，Hydro在氧化剂的作用下所产生的氧化产物，与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，在550 nm测定Hydro含量，具体操作按照Hydro测定试剂盒。考马斯亮蓝法测定总蛋白含量，具体操作按照总蛋白测定试剂盒进行。Hydro含量计算公式：

1.6 小鼠心室HE染色和M asson染色 小鼠心脏样本在10%甲醛溶液中固定、石蜡包埋、切片，进行HE和Masson染色，观察心肌纤维化的程度和胶原的含量，采用自动成像分析系统（Visilog 4.1.5，Noesis），计算心肌胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）。CVF为胶原的面积占总面积的比值。

1.7 CollagenⅠ mRNA测定 小鼠左心室匀浆后，用TRIzol提取总RNA，进行逆转录和PCR。CollagenⅠ的引物：上游 5′-ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC-3′，下游 5′-CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT-3′，扩增片段长度为169 bp，退火温度为55℃。GAPDH的引物：上游 5′-GTATGACGTGGAGTCTACTG-3′，下游 5′-TACTCCTTGGAGGCCATGTA-3′，扩增片段长度为728 bp，退火温度为56℃。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，结果经凝胶扫描图像处理系统分析，以CollagenⅠ基因扩增带灰度与同管扩增的GAPDH基因扩增带灰度之比表示CollagenⅠmRNA表达水平。

1.8 统计学处理 实验数据以±s表示，显著性检验采用one-way ANOVA。

2 结果

2.1 对CW I和小鼠心肌中Hydro含量的影响 皮下注射异丙肾上腺素后，模型组的CWI和Hydro含量均较溶媒对照组明显增加（P＜0.01），见Fig 1和Fig 2。

Fig 1 Com parison of CW I from control group and model group（±s，n＝10）**P＜0.01 vs control group

Fig 2 Comparison of Hydro content in m yocardial tissues from control group and model group±s，n＝10）**P＜0.01 vs control group

2.2 小鼠心室HE和M asson染色结果 HE染色和Masson染色结果如Fig 3和Fig 4A所示，溶媒对照组心肌细胞排列整齐，形状基本一致；模型组心肌细胞间可见有较多的纤维组织。CVF计算结果显示，模型组较溶媒对照组明显增加（P＜0.01），见 Fig 4B。

Fig 3 Com parison of histopathological changes ofm yocardial tissues from control group and model group（HE staining，400×）A：Control group；B：Model group

Fig 4 Comparison of histopathological changes ofmyocardial tissues from control group and model group by Masson staining（40×）a：Control group；b：Model group；B：CVF（x¯±s，n＝10）.**P＜0.01 vs control group

2.3 心肌CollagenⅠ mRNA的表达 RT-PCR结果显示，与对照组比较，模型组CollagenⅠmRNA表达明显增加（P＜0.01），见 Fig 5。

Fig 5 Com parison of CollagenⅠm RNA expression in the left ventricle from control group and model group（x¯±s，n＝10）**P＜0.01 vs control group

3 讨论

异丙肾上腺素在诱导小鼠心肌纤维化的过程中，通过激活RAAS系统，明显增加血浆中肾素、醛固酮和血管紧张素转化酶（ACE）活性［9］，增加血浆中血管紧张素Ⅱ，而醛固酮通过盐皮质受体增加心肌AT l受体水平［10］，进而血管紧张素Ⅱ通过激活ATl受体降低心肌成纤维细胞中胶原酶的活性［11］，最终增加心肌间质胶原的合成，促进心肌纤维化的发生发展［12-13］。

我们通过前期的预实验和本研究发现，在用异丙肾上腺素制备小鼠心肌纤维化模型的过程中，异丙肾上腺素皮下注射的剂量、间隔时间和环境温度是模型成功与否的3个关键因素。异丙肾上腺素是β受体激动剂，作用于心脏β1受体，使心肌收缩力增强、心率加快、心输出量和心肌耗氧量增加。异丙肾上腺素皮下注射剂量过大，是导致小鼠死亡的直接原因。但是，若是皮下注射异丙肾上腺素剂量过小，小鼠通过自身代偿机制，又不容易形成纤维化。因此，如何选择一种合适的剂量，使小鼠容易形成心肌纤维化，又不致死，是该模型能否成功的关键因素之一。我们在预实验的研究中，异丙肾上腺素首先从40 mg·kg-1初始剂量皮下注射开始摸索，结果发现，每次皮下注射后都会有不同数量的小鼠死亡，随着给药天数的增加，最后存活的小鼠所剩无几。所以，我们逐渐降低异丙肾上腺素的给药剂量，最后发现，首剂给予冲击剂量5 mg·kg-1，后以2.5 mg·kg-1维持 30 d，每天同一时间注射1次，是小鼠不致死又能造成心肌纤维化模型的适当剂量和给药间隔。心肌纤维化时，心肌组织中胶原纤维过量积聚，心肌胶原主要包括CollagenⅠ和CollagenⅢ，其中CollagenⅠ约占胶原总量的80%～85%，通过测定心肌组织Hydro含量来作为心肌纤维化的标志［14］（1 g Hydro相当于8.2 g胶原蛋白）［15］，肉眼可以观察到心脏体积和重量的增加（用CWI表示）。实验结果显示，在该注射方案下，心肌纤维化模型组小鼠的CWI、Hydro含量以及CollagenⅠmRNA表达明显增加，HE和Masson染色可更加直观地看出模型组小鼠心肌组织中的胶原明显增加，心肌细胞排列不整齐，心肌细胞间可见有较多的纤维组织。另外，环境温度控制也非常关键，环境温度过高，加快异丙肾上腺素的吸收，也容易导致小鼠的死亡，尤其是在天气炎热的季节，更应严格控制动物房内的环境温度。一般将温度控制在18～22℃之间为宜。

本研究通过皮下注射异丙肾上腺素成功制备了小鼠心肌纤维化模型，相比于其他造模的方法，该方法不需要开腹、开胸，损伤小，死亡率很低；用小鼠做实验更加易于操作；同时，该方法制备的模型符合缺血性心肌损伤的病理进程，是制备心肌纤维化理想的动物模型，为心肌纤维化的研究提供了一种简便、经济、可靠的小鼠模型。

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