α突触核蛋白作用核苷酸序列的体外筛选研究

马开利，宋连昆，苑玉和，张 莹，李 莉，杨金玲，朱 平，陈乃宏

（1.中国医学科学院·北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室，药理学研究室，北京 100050；2.中国医学科学院·北京协和医学院医学生物学研究所，云南昆明 650118）

α突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）最早发现其定位于突触前末端及细胞核［1］，随后的大量研究表明，α-syn的核定位存在于包括培养的细胞［2-3］、αsyn转基因果蝇［4］及小鼠［5］在内的各种实验系统内。近来的研究表明，α-syn的核定位可能在帕金森病的发病中发挥重要作用。Zhou等［6］的研究表明，α-syn的核转位增加能够引起多巴胺能细胞对氧化应激的敏感性增加。Boyer等［7］的进一步研究表明，α-syn引起的核聚集能够导致大鼠可卡因相关的行为发生变化。因此，α-syn的核转位可能是共核蛋白病的致病机制。

我们前期的研究表明，α-syn可同时存在于胞核和胞质中，进一步研究发现，α-syn能够在核输入蛋白importinα的介导下进入细胞核，通过影响细胞周期而发挥毒性作用［8］。为了进一步弄清α-syn在胞核内的作用，本研究拟从核内的核苷酸序列角度出发，应用圆二色谱（circular dichroism，CD）分析的方法，在体外筛选可能被α-syn作用的核苷酸序列，为阐明α-syn核内的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 核苷酸序列合成 核苷酸序列（Tab 1）由Invitrogen公司合成，并溶解于CD缓冲液（40 mmol·L-1citrate pH 5.6，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA），终浓度为100μmol·L-1。

Tab 1 O ligonucleotide sequence

1.2 圆二色谱分析 首先测定蛋白质和核苷酸序列的紫外（ultraviolet，UV）光谱，计算出储存液浓度，然后测定缓冲液相对于比色皿的UV吸收谱。综合分析得到数据，确定本实验中所用的蛋白和核苷酸序列的浓度。圆二色谱仪完成升温后，取干净比色皿加入缓冲液，放入仪器扫描基线值（波长范围230～410 nm），重复扫描两次，取平均值以降低噪声。基线扫描完成后，在相同条件下向比色皿中加入核苷酸序列溶液并进行色谱扫描。完成后，在相同条件下将蛋白与核苷酸序列的混合液注入比色皿，并进行色谱扫描。

Fig 2 CD spectra of nucleotide sequence composed of AC10，AG10，AT10，GC10，GT10 or TC10 after the adding ofα-syn-GFP protein

2 结果

2.1 α-syn-GFP蛋白对含碱基A的序列有较强作用 从Fig 1可以看出，对于含碱基A的序列而言，α-syn-GFP蛋白的加入能够引起260～290 nm之间的色谱峰强度降低，而250 nm左右的色谱峰强度增加。因此，α-syn-GFP蛋白对含碱基A的序列有较强作用。而α-syn-GFP蛋白的加入仅使含碱基T的序列230～260 nm间的色谱峰稍有增加、含碱基C的序列290 nm左右的色谱峰稍有增加。因此，相对于含碱基A的序列来说，α-syn-GFP蛋白对分别含碱基T和C的序列的作用较弱。

2.2 α-syn-GFP蛋白对分别含碱基AG、TC的序列有较强作用 从Fig 2可以看出，对于含碱基AT、AC、GC和TC的序列而言，α-syn-GFP蛋白的加入，并未对色谱峰产生明显的影响，而α-syn-GFP蛋白的加入对分别含碱基AG、TC的序列的色谱峰有较大的影响。α-syn-GFP蛋白的加入导致含碱基AG的序列色谱峰在250～280 nm之间出现明显的降低，并且整个峰发生了蓝移。同样，对于含碱基TC的序列而言，α-syn-GFP的加入导致整个色谱峰亦发生了蓝移，且260～280 nm之间的峰强度有所降低。因此，α-syn-GFP蛋白与分别含碱基AG、TC的序列有较强作用。

2.3 α-syn-GFP蛋白对Kazak序列无明显作用从Fig 3可以看出，无论是Kazak1序列、Kazak2序列，还是它们之间相互组合所形成的序列，α-syn-GFP蛋白的加入均未对色谱峰产生明显影响，仅表现出小幅度的变化。

Fig 1 CD spectra of nucleotide sequence composed of A30，T30 or C30 after the adding ofα-syn-GFP protein

Fig 2 CD spectra of nucleotide sequence composed of AC10，AG10，AT10，GC10，GT10 or TC10 after the adding ofα-syn-GFP protein

2.4 α-syn-GFP蛋白对GC-box样序列有较强作用从Fig 4可以看出，α-syn-GFP蛋白的加入对CAAT-box及增强子样序列的作用亦较弱，而α-syn-GFP蛋白加入可导致GC-box样序列色谱峰270 nm处峰强度明显增加，推测可能是α-syn-GFP与GC-box样序列发生特异作用，引起GC-box样序列结构发生明显变化的结果。

Fig 3 CD spectra of nucleotide sequence composed of Kazak1，Kazak2，Kazak1＋1，Kazak1＋2 or Kazak2＋2 after the adding ofα-syn-GFP protein

Fig 4 CD spectra of nucleotide sequence com posed of CAAT-box like，GC-box like or Enhancer after the adding ofα-syn-GFP protein

3 讨论

α-syn广泛分布于大脑神经元的细胞核内［1-2，5，9-10］。我们前期的研究表明，α-syn能够在importinα的介导下进入细胞核，并干扰细胞周期。因此，我们推测α-syn可能作用于细胞核内的某些核苷酸序列，从而对细胞周期产生了影响。在此我们主要从体外角度出发，寻找可能被α-syn作用的核苷酸序列的特征，由于前期α-syn核输入机制及功能的研究所用的α-syn蛋白均为与GFP融合的蛋白［8］，我们已有研究表明，GFP蛋白的引入几乎不影响α-syn对核苷酸序列的作用。因此，为保证实验体系的一致性和研究的连续性，本研究选用经酵母表达并进行纯化的α-syn-GFP蛋白进行。

圆二色谱已被广泛应用于蛋白质的二级结构预测分析［11-12］。正常生理条件下，细胞内存在的核酸通常呈现出多种不同的构象［13］。近来的研究表明，核酸的结构参数与它们的圆二色谱峰之间存在相互关联的关系［14-15］，核酸和蛋白紫外吸收谱的重叠可用于研究核酸-蛋白质间的相互作用。事实上，250～300 nm间的圆二色谱峰是由核酸的结构来决定的，因为在此波长范围内，相对于核酸而言，蛋白质芳香发射基团的作用是相对较弱的［16］。因此，本研究选择波长范围在250～300 nm间的圆二色谱峰的强度进行研究。

为了寻找可能被α-syn作用的核苷酸序列的特点，我们根据核酸组成及现有的相关顺式作用元件的特点，合成了一系列的单链核苷酸序列，应用圆二色谱分析α-syn蛋白对序列的影响，从中发现可能被α-syn作用的核苷酸序列的序列特点。

首先，我们分别合成了含30个碱基的序列，与α-syn-GFP蛋白混合后，用圆二色谱分析α-syn-GFP蛋白对序列的影响。由于核酸的结构变化主要表现为波长范围250～290 nm内色谱峰的变化，因此，我们把α-syn-GFP蛋白加入后250～290 nm范围内色谱峰的变化情况作为主要的观察范围。结果表明，对于含碱基A的核苷酸序列而言，色谱峰上270 nm左右的峰强度出现降低，而250 nm左右的峰强度则表现为增加。另外，α-syn-GFP对分别含碱基C或T的核苷酸序列的影响较弱，仅表现为290 nm或250 nm左右的峰强度稍有增加。因此，α-syn-GFP蛋白可能更倾向于影响含碱基A的核苷酸序列。

为了进一步获得可能被α-syn作用的核苷酸序列的特征，我们增加了核苷酸序列组合的复杂性，以两两碱基组合的方式合成了分别含有10对碱基AT、AG、AC、GT、GC、TC的核苷酸序列。圆二色谱分析结果表明，对于含AG的核苷酸序列而言，αsyn-GFP加入后色谱峰在270 nm左右的峰强度明显降低，而250 nm左右的峰强度则增加，并且整个峰出现了蓝移。同样，α-syn-GFP蛋白的加入也使含TC的核苷酸序列的色谱峰270 nm和250 nm左右的峰强度都有所降低，整个峰也出现了蓝移。因此，α-syn-GFP蛋白对分别含碱基AG或TC的序列有较强作用。然而，对于其余组合的核苷酸序列而言，色谱峰并无明显变化。

综合分析上述研究所得出的可能被α-syn-GFP作用的核苷酸序列的特点，我们推测CAAT-box样序列、Kozak序列、GC-box样序列、增强子序列等序列可能是α-syn-GFP主要作用的核苷酸序列。因此，我们分别合成了这些序列，并应用圆二色谱进行分析。结果表明，无论是Kozak1、Kozak2，还是这两种序列的组合，圆二色谱峰仅在波长270 nm时峰强度稍微有所增加。因此，α-syn-GFP对Kozak序列的作用不明显。对CAAT-box及增强子样序列而言，αsyn-GFP蛋白的加入亦未对其色谱峰产生明显影响，而α-syn-GFP蛋白的加入却导致GC-box样序列的色谱峰发生强烈的变化，表现为波长270 nm处峰强度明显增加，推测可能是α-syn-GFP与CAAT-box样序列发生了特异作用，从而导致GC-box样序列结构发生明显变化的结果。

综上所述，α-syn转位进入细胞核后可能通过作用于GC-box样序列，参与细胞核内的基因表达调控，从而发挥生理或病理作用。

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