镰刀菌色素抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖的机制

郑里翔，蔡宇杰，孟宪明，徐敏娟，李昌伟，王巧凤，王 月，廖祥儒

（1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江西中医药大学基础医学院，江西南昌 330004）

乳腺癌是严重威胁人类生命健康的重大疾病之一，现阶段治疗的主要手段是手术、放疗 、化疗，但对人体创伤较大，并且有严重的副作用，严重影响患者的生活质量，故研发毒副作用小、疗效好的新型抗乳腺癌药物尤为重要。近年来的研究表明：植物中色素毒副作用小，有较强的抗癌活性［1-2］。由于受到资源保护、环境因素等条件的限制，人们把注意力转移到微生物产色素方面。镰刀菌是真菌中一个常见且重要的种属，在环境中分布极为广泛，易培养、对营养物质要求不高、且抗毒性强。过去人们的注意力多集中在镰刀菌所产毒素的危害上，很少注意它们的有益之处［3-4］。本实验室筛选的一株镰刀菌（Fusarium sp JN158），它能产色素［5-6］，初步鉴定具有抑制乳腺癌等不同种类的肿瘤细胞增殖，但目前这类化合物的结构、功效及机制尚不清楚。本课题将对镰刀菌产色素的结构进行鉴定，并对其影响MCF-7乳腺癌细胞增殖及机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 葡萄糖、果糖、二甲基亚砜（DMSO）、三氟乙酸（TFA）等均为分析纯，购自上海国药集团；四甲基偶氮唑盐（MTT）：购自美国Sigma公司。鼠抗人VEGF单克隆抗体、鼠抗人Cyclin D1单克隆抗体、鼠抗人NF-κB p65单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司；乌苯美司购于上海化学试剂公司。

1.1.2 细胞株 人乳腺癌细胞MCF-7、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购自中国医学科学院上海细胞所。

1.2 方法

1.2.1 镰刀霉菌的培养及色素提取 从斜面培养基上挑取菌落，转接到有种子培养基的三角瓶（250 ml三角瓶中装液量50 ml），旋转式摇床设定温度30℃，200 r·min-1转速培养 36 h，以5%的接种量接种到50 L的发酵罐中发酵72 h。发酵液经10 000×g离心10 min，收集紫色菌体，加入4倍体积的95%酸性乙醇溶液（乙醇 ∶盐酸＝9∶1）浸提过夜，得到色素提取液，用1 mol·L-1NaOH调pH至7.8左右，离心得到紫色沉淀，即为色素粗品。

1.2.2 LC/MS对色素组分的制备与分析 色素提取物经LC/MS分离，通过Masslynx V4.1软件分析出色素的主要组分及其分子质量。

1.2.3 HPLC分离色素 分离条件为色谱柱Phecda C18（5μm，4.6 mm×250 mm），柱温 25℃；DAD检测器检测波长254 nm；流量1.0 ml·min-1，进样量10μl，流动相A是含体积分数0.1%TFA（氟乙酸）的乙腈，流动相B是含体积分数0.1%TFA的蒸馏水梯度洗脱程序（Tab 1）。

Tab 1 Gradient program ofmobile phase

1.2.4 镰刀霉菌发酵产紫色素结构的分析

1.2.4.1 紫外光谱分析 取紫色素纯品2 mg溶于乙腈-三氟乙酸（10∶1）中，通过 Waters Platform ZMD4000进行液质分析，液相扫描选择的波长为200～750 nm，然后利用Masslynx V4.1软件分析出该色素紫外图谱。

1.2.4.2 红外光谱分析 取紫色素纯品2 mg，与200 mg干燥的KBr研磨混匀，用傅立叶变换红外光谱仪在4000～400 cm-1区间扫描，扫描次数：32次，分辨率：4 cm-1。

1.2.4.3 核磁共振（NMR）分析 用氘代三氟乙酸将待测样品溶于5 mm标准的NMR管中，加入少量TMS作为基准参照物进行测定。

1.2.5 MTT比色法测定不同浓度的色素对MCF-7细胞增殖的影响

1.2.5.1 细胞培养 将MCF-7细胞置于含10%胎牛血清的 RPMI 1640培养液中，在37℃、5%CO2的培养箱中贴壁生长，用0.25%胰酶消化传代。

1.2.5.2 实验分组与处理 将MCF-7细胞按上述方法培养，选择对数生长期的细胞随机分为空白对照组（BG）、色素实验组（EG）、色素对照组（EGC）、乌苯美司（UB，下同）组、乌苯美司对照组（UBC）。色素实验组终浓度分别为 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15×10-3mmol·L-1，色素对照组加等体积盐酸乙醇；乌苯美司溶解于含1%的冰醋酸培养基中，终浓度为10 mmol·L-1，对照组加等体积的含1%的冰醋酸培养基。MTT方法参照郑里翔等［7］提供的方法，具体为将制好的含细胞的完全培养液加入96孔培养板中，对照组加入含等体积盐酸乙醇或冰醋酸的新鲜完全培养液；阳性药物乌苯美司终浓度为（IC50）10 mmol·L-1［8］。每组均为 15个复孔，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度（A）值。抑制率（IR）＝（A对照-A药物）/A对照×100%。

1.2.6 Western blot 用含色素的培养基培养细胞24 h，收集细胞，加入细胞裂解液，冰浴 1 h，4℃12 000 r·min-1，离心 30 min，吸出上清液，即为细胞胞质总蛋白，采用考马斯亮蓝方法测定蛋白含量，以每孔8×10-2mg的蛋白量，SDS-PAGE电泳 、转膜，BSA 37℃封闭2 h，加入BSA稀释的鼠抗人 CyclinD1、VEGF、NF-κB p65单克隆抗体（1∶200），4℃过夜，加入标记有 HRP的二抗（1∶2 000）37℃孵育2 h，ECL显色，采用 FC-2凝胶成像系统（美国APHAR公司）分析蛋白表达量。蛋白的表达量通过灰度比值计算，即灰度比值＝目的条带的灰度/βactin灰度。

1.3 统计学方法 应用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，数据采用¯x±s表示。两组间比较采用LSD、Hochberg、Games-Howell统计学方法进行统计处理。

2 结果

2.1 利用LC/MS及HPLC对镰刀菌产色素的分离纯化 镰刀菌产色素经过LC/MS分离，出现了6个主要峰，出峰时间分别为 2.67、3.14、3.64、3.74、4.18、5.36 min，总的时间大约是15 min。质谱扫描后，通过Massly-nx V4.1软件进行分析，得到这6种组分的分子质量分别为 354.0、368.0、368.0、382.0、368.0、382.0，分子质量之间平均相差 14，其中，3种分子质量为368.0，两种分子质量为382.0的应该是结构类似物。

同时，使用 HPLC分离色素，出现6个峰（图1A），与LC/MS分析的出峰数基本上一致，分别标记成Ⅰ～Ⅵ（Fig 1A），Ⅵ峰的峰相对最高，与周围杂峰距离也较远，较易分离纯化，所以只对这一组分进行了制备，纯度可达98%（Fig 1B）。

Fig 1 HPLC separates pigmentA：All peaks of the pigment；B：The peak of NO.6 pigment.

2.2 镰刀菌产Ⅵ号色素峰结构的鉴定

2.2.1 色素的紫外光谱分析 通过LC/MS的分析，得到该色素的紫外吸收光谱，该化合物在紫外区有两条吸收带，分别为253 nm和274 nm，可初步判断该色素是一种带苯环的化合物。

2.2.2 色素的质谱分析 一级质谱主要是用于分析目标分子的分子质量，该紫色素的一级质谱图，分子质量为382.0。

2.2.3 色素的红外光谱分析 红外光谱是记录有机分子吸收红外光后，产生化学键振动而形成的光谱吸收，测定范围一般为4 000～400 cm-1，常用来确定各种羧基、烷烃、芳环及炔烃等基团的特征吸收峰。该紫色素的红外光谱分析结果汇总见Tab 2。

Tab 2 The infrared spectrum results of purp le pigment

2.2.4 色素的核磁共振（NMR）分析

2.2.4.11H NMR图谱分析 从图谱的位移值及峰形来看，化学位移11.500为烯醇的H；化学位移5.384与芳环中的羟基中的 H一致；化学位移3.908为醇羟基中的H；化学位移4.550为甲氧基相连的CH2中的H；化学位移4.053与羟基相连的CH2的H一致；化学位移4.486为C＝C-OCH3中的H；化学位移3.527为C-C-OCH3中的H。

2.2.4.213C NMR图谱分析 从图谱的位移值及峰形来看，化学位移178.67、176.12与羧基中的C一致；化学位移53.12、53.71、55.68为甲氧基中的C，表明该色素含有3个甲氧基，其中2个是对位的，与氢谱结果一致；化学位移157.42为苯环中与羟基相连的C；化学位移为C＝C中接羟基的碳；化学位移56.27与C-OH中的C一致。

结合色素的性质及质谱与红外的光谱分析，通过 COSY（correlated spectroscopy）、HMQC（heteronuclear multiple quantum coherece）、ROESY（rotaing frame overhauser effect spectroscopy）及 MLEV［M.Levitt（broadband composite decoupling sequence）］对1H、13C核磁共振谱峰进行准确的归属，确定了该色素的分子质量为382.0，分子式为C17H18O10，结构见Fig 2。

2.3 不同浓度的VI号化合物对MCF-7细胞增殖的影响 MTT比色法检测镰刀菌（Fusarium sp JN158）产VI号化合物对MCF-7肿瘤细胞增殖的影响。使用5～15μmol·L-19个不同浓度的VI号化合物作用于MCF-7细胞24 h，以乌苯美司（ubenimex，IC50）为阳性药物。乌苯美司是从网状橄榄链霉菌培养液中发现的一种具有抗菌作用和免疫增强作用的小分子二肽化合物，分子质量约380，与VI相似，已有临床研究表明乌苯美司可治疗人乳腺癌、人白血病等［9］。通过酶联免疫检测仪而测出的490 nm波长下的各组吸光度（A）值，见Tab 3。

根据MTT比色法测得的A值，各实验组（EG）的A值与对照组（Con）A值比较，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；随着该色素浓度的增加，对MCF-7细胞增殖的抑制率（IR）逐渐升高，呈现浓度的依赖性。在11×10-3mmol·L-1时，肿瘤细胞增殖的抑制率达50%，但对正常HUVEC细胞作用不明显。由于UB（乌苯美司）IC50（10 mmol·L-1）的浓度是色素实验组IC50浓度的900倍，说明VI化合物是一种活性成分非常高的化合物，可能是一种非常有前景的抗MCF-7乳腺癌细胞化合物。

2.4 镰刀霉菌所产VI号化合物对人乳腺癌MCF-7细胞内CyclinD1、NF-KB p65、VEGF蛋白表达的影响 依据表3的研究结果，分别取11×10-3、13×10-3mmol·L-1二个浓度（简称 11、13）的Ⅵ化合物对癌细胞内的 CyclinD1、NF-κB p65、VEGF蛋白表达影响进行研究。

实验结果表明：不同浓度的Ⅵ化合物作用MCF-7细胞 24 h后，NF-κB p65、VEGF、CyclinD1蛋白表达量均低于对照组，差异有显著性（P＜0.01或P＜0.05，Tab 4），且随药物浓度增高，表达量逐渐下降；在Ⅵ化合物为11×10-3mmol·L-1（IC50）时，上述3种蛋白表达量与UB（乌苯美司）组比较无差异（P＞0.05，Tab 4，Fig 3）；当色素浓度在 13×10-3mmol·L-1时，NF-κB p65、VEGF、CyclinD1蛋白的表达量差异虽然无统计学意义（P＞0.05，Tab 4，Fig 3），但低于UB组，提示：Ⅵ色素化合物对MCF-7细胞增殖的抑制作用可能与抑制 NF-κB p65、VEGF、CyclinD1蛋白表达有关。

Tab 3 Effect of com pounds of different concentrations on MCF-7 cancer cell proliferation

Tab 4 Effect of VI compound on protein expression±s）

Tab 4 Effect of VI compound on protein expression±s）

ΔP＜0.05；ΔΔP＜0.01 vs Control；*P＜0.05 vs UB

Group/×10-3mmol·L-1 CyclinD1NF-κB p65VEGF Control EG BG 1.21±0.38（8） - 1.28±0.32（7） - 1.29±0.23（6）Control EG Control EG-13 0.90±0.10 0.52±0.14*（7） 0.99±0.16 0.69±0.15ΔΔ（8） 0.86±0.12 0.51±0.13*ΔΔ（7）UB 0.87±0.12 0.64±0.08ΔΔ（5） 0.97±0.19 0.74±0.09Δ（4） 0.91±0.19 0.61±0.11ΔΔ（5）11 0.98±0.08 0.69±0.20Δ（6） 1.04±0.14 0.75±0.17Δ（7） 0.89±0.17 0.69±0.07Δ（8）

Fig 2 Structure of No.6 com pound

Fig 3 W estern blot of CyclinD1，NF-κB p65，VEGF protein

3 讨论

通过筛选天然产物和它们的结构类似物发现抗肿瘤药物，是目前较为通行的做法。近年来的研究表明，天然植物、水果、蔬菜等分离的色素（如胡萝卜素、番茄红素、姜黄素、花青苷类等）具有抗肿瘤的活性［10-12］。然而，受到植物的生长周期长、季节等因素的限制，人们把注意力转移到微生物上，因微生物生长不受环境、空间的限制，且代谢产物种类繁多，可以为天然色素的开发提供广阔的空间。如目前已经大量的研究证明的灵菌红素（PGs），是由微生物（如粘质沙雷菌、革兰阴性细菌）产生的天然红色素，其抗肿瘤潜在活性已经得到广泛的证实。灵菌红素有共同的结构 PPM（pyrrolylpyrromethene），该家族在不同的细菌均可产生，PGs是一类起免疫抑制作用的色素，体外的研究表明可以促凋亡抗肿瘤活性。另外，叶明等从暗盘菌发酵代谢产物中提取了一种较稳定的黑色素；赵东红等用一株链霉菌进行液体深层发酵，并从发酵代谢物中获得了蓝色的天蓝菌素（coelicolorin）［10］。虽然已对微生物来源的天然色素进行了大量的研究工作，但对镰刀菌为产生菌的天然红色素的研究报道较少。目前，尚未见镰刀菌Fusarium spJN158产色素抗肿瘤活性的研究报道。

本研究结果表明：镰刀菌（Fusarium spJN158）产色素具有其独特之处，该色素的混合物溶解于酸乙醇中（pH 1～2），呈现鲜红，当pH调节至7～8（用NaOH调节pH值）时，出现紫黑色沉淀。沉淀的色素通过HPLC分离，可得到6个不同的峰。其中Ⅵ号峰远离前5个峰，便于分离（Fig 1B）。从其分离的结果表明，纯度较高，可达98%（Fig 2B）。通过红外、质谱、核磁共振对VI色素化合物的结构分析可知：此色素可能是一种花青苷类色素，分子质量为382，结合有机元素实验数据，推测此色素可能的分子式是C17H18O10。通过数据库查新可知，没有这种分子式报道，考虑到该色素特殊的溶解性，可能是一种新的骨架结构，值得进一步研究。

由于该化合物的结构独特，本实验室对其活性进行研究发现：该化合物对肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌及大肠癌均有不同程度的抑制作用（数据未在文章中显示），并呈现浓度的依赖性，尤其是对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用明显（P＜0.01），在浓度11×10-3mmol·L-1时，肿瘤细胞的抑制率可达50%；而阳性药物乌苯美司的IC50为10 mmol·L-1，是VI色素化合物的900倍，说明该化合物可能是一种抗乳腺癌活性非常高的小分子化合物。

为研究VI色素化合物对MCF-7细胞的抑制作用机制，课题组选用11、13×10-3mmol·L-12个不同浓度的VI号化合物，分别对肿瘤细胞增殖、肿瘤转移起重要作用的CyclinD1、NF-κB及VEGF基因表达产物进行研究，结果证实：上述2个不同浓度的VI号化合物对 MCF-7细胞中CyclinD1、NF-κB p65、VEGF蛋白表达均有不同的抑制作用，并呈现浓度的依赖性（P＜0.05或P＜0.01）。

由于CyclinD1与乳腺癌发生、进展紧密相关，乳腺细胞内 Cyc1inD1过度表达，形成 CyclinD1-CDK4/6复合物明显增多，大量CDK4/6被磷酸化，激活其介导的pRB磷酸化路径，使乳腺细胞失控性生长，导致乳腺癌的形成。抑制CyclinD1表达则可以控制肿瘤细胞的增殖速度，减缓肿瘤的进展［13］。

核转录因子Kappa B（NF-κB）是肿瘤细胞增殖重要的调控因子，所调控的基因有180种之多，包括血管内皮细胞生长因子（VEGF）。VEGF的启动子上有NF-κB的特异性结合靶点，封闭裸鼠乳腺癌中NF-κB的表达，VEGF等多种促血管生成因子的表达下降［14］，说明 NF-κB在肿瘤的发生、发展、转移方面发挥重要作用［15］。故 VI号化合物抑制 CyclinD1、NF-κB、VEGF蛋白表达，从而抑制了 MCF-7细胞的增殖。

由于花青苷类色素是黄酮类化合物，在天然植物中的分布最广，已经证实具有抗菌、抗肿瘤的活性［16］。但每种色素抗肿瘤活性的机制不同，故镰刀菌产VI号化合物抑制MCF-7细胞增殖，其机制可能是抑制 CyclinD1、NF-κB、VEGF的表达，从而抑制乳腺癌细胞增殖。当然上述的这些机制，可能只是抗肿瘤活性的一个方面，其更为重要的作用机制将是本课题组今后研究的重要工作。

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