ABCB5和MDR1对急性髓系白血病耐药的影响

李真真，张晓龙，杨雨琪，张 晴，袁向飞，范冬梅

（1.中国医学科学院·北京协和医学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津 300020，2.天津医科大学药学院，天津 300070）

急性髓系白血病（acutemyeloid leukemia，AML）化疗失败及复发的主要原因是白血病细胞对化疗药物产生多药耐药现象（MDR）［1］，即肿瘤细胞接触一种化疗药物继而产生耐药的同时，对多种结构不同、作用机制各异的其它化疗药物也产生交叉耐受性；而MDR的最经典机制是肿瘤细胞高表达ATP-binding cassette（ABC）转运蛋白家族成员，如P-gp（其编码基因为肿瘤多药耐药基因MDR1），高表达的P-gp可以利用水解ATP的能量将各种药物从细胞内转运到细胞外，降低药物在细胞内的浓度，并使其细胞毒作用减弱直至消失［2］。临床上，MDR1基因及其表达产物P-gp的高表达与肿瘤化疗耐药、复发和预后差等密切相关。Liu等［3］研究发现10例复发B细胞淋巴瘤患者中8例MDR1/P-gp高表达，14例对照组患者中4例MDR1/P-gp高表达；其中对照组中MDR1阳性者生存时间明显低于阴性者（分别为12.7和29.0个月）；同样的，有近50%的AML患者其白血病细胞高表达 MDR1（ABCB1；P-gp），并往往伴随着复发以及预后差等现象［4］。所以，理论上讲，针对P-gp的药物泵抑制剂能够极大程度的逆转AML的MDR现象并改善病人预后［5-6］，但是，也有部分临床试验结果显示：联用外排泵抑制剂并未能明显改善病人预后［7］。我们推测在AML白血病细胞表面可能还有其它外排泵的表达。

ABCB5是近些年发现的表达于某些黑色素瘤表面的ABC超家族另一成员，在CD133＋的亚群细胞中高表达，被认为是黑色素瘤肿瘤干细胞的标志之一，并且与疾病的进展及预后密切相关［8］；作为外排泵，ABCB5与肿瘤细胞耐受蒽环类抗生素及紫杉醇类药物相关［9］。另外，Wilson等［10］研究也发现，ABCB5可以作为结肠癌患者中难治并导致复发的肿瘤干细胞的分子标志。这些结果表明，ABCB5在实体瘤，尤其是恶性黑色素瘤及结肠癌的耐药及复发，乃至肿瘤干细胞中扮演重要角色。目前，关于ABCB5在血液系统的研究还很少，仅Frank等［11］在耐长春新碱的细胞株K562VCR中发现ABCB5的高表达，并伴随着白血病干细胞相关基因的激活，说明ABCB5也许代表着白血病干细胞的一种可能耐药机制。本研究以来源于AML的干祖细胞系KG1a为例，旨在探讨AML相关的耐药机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 KG1a购自ATCC，由中国医学科学院实验血液学国家重点实验室细胞库。IMEM培养基粉末、胎牛血清、胰酶购自Gibco公司；lipo2000、TRIzol、M-MLV逆转录试剂盒购自 Invitrogen；MTT、盐酸阿霉素（ADR）、维拉帕米（Vera）、Rhodamine123、DMSO购自Sigma公司；SYBR Premix购自TaKaRa；RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF购自江苏海门碧云天生物研究所；P-gp直标抗体、PE二抗购自BD公司；ABCB5抗体购自Abcam。

1.2 病人标本 71例来源于AML病人外周血单个核由中国医学科学院血液病医院提供，病人及家属均知情同意，并经医院伦理委员会批准。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 KG1a细胞常规培养于含10%FBS的IMEM培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱，每2～3天传代1次；取对数生长期细胞进行实验。

1.3.2 细胞转染 取对数生长期的KG1a细胞，调整细胞密度为2×108·L-1后接种于6孔板中，4×105个/孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；次日转染之前更换无血清培养基，然后分别用250μl opti-MEM稀释100 pmol siRNA和5μl lipo2000，室温放置5 min后，将二者混合，室温孵育20 min，最后把混合物加入预先更换培养基的KG1a细胞中，培养6 h后更换为含10%FBS的IMEM培养基，转染后48 h或72 h进行其它实验。人源ABCB5的siRNA靶序列为 5′-GCTGGAAAGATAGCAACTGAA-3′（1 828 bp-1 848 bp），由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.3.3 Western blot检测KG1a细胞中ABCB5及P-gp的表达情况 取对数生长期的KG1a及转染siRNA后48 h的KG1a细胞，RIPA裂解后提取细胞总蛋白，蛋白定量后用于Western blot检测。先进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白样品转移至硝酸纤维素（NC）膜，封闭后 2 h分别孵育 ABCB5抗体（1∶1 000稀释）、P-gp抗体（1∶1 000稀释）及GAPDH抗体（1∶2 000稀释），4℃过夜，PBST洗涤3次，每次10 min；再与二抗室温孵育1 h，PBST洗涤3次，每次10 min，化学发光法（ECL）显影。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞表面ABCB5及P-gp的表达 取对数生长期的KG1a细胞，预冷的PBS洗涤两次，加入P-gp直标抗体，室温避光孵育0.5 h，应用BD LSRⅡ数字化分析型流式细胞仪检测和分析数据；取对数生长期的KG1a，预冷的PBS洗涤两次，预冷的80%甲醇固定细胞5 min，0.3 mol·L-1甘氨酸封闭细胞30 min，加入ABCB5抗体室温孵育1 h，加入PE二抗后，室温避光孵育30 min，上机检测。

1.3.5 Rhodamine123检测外排泵功能 取对数生长期的KG1a，预冷PBS洗涤两次，维拉帕米组预先加入终浓度为25 mg·L-1的维拉帕米37℃水浴震荡培养30 min，然后与其它实验组一起加入2 ml含终浓度为100μg·L-1的Rhodamine123的无血清培养基，37℃水浴震荡培养90 min，离心弃上清，500 μl PBS重悬，FITC通道检测细胞内蓄积的荧光强度。

1.3.6 MTT法检测细胞对化疗药物敏感性 取对数生长期或转染siABCB5后48 h的KG1a细胞，接种于96孔板，1×104个细胞/孔，24 h后，加入不同浓度的药物，每个药物梯度设3个复孔，然后置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养72 h，加入终浓度为0.5 g·L-1MTT，37℃、5%CO2培养箱避光孵育4 h，然后弃上清，加入150μl DMSO，振荡溶解甲臜，用酶标仪测定570 nm的光吸收值。

1.3.7 Real-Time PCR的方法在mRNA水平检测ABCB5及P-gp的表达 取临床病人外周血标本，加入15 ml的生理盐水洗1遍后重悬，然后缓慢加入等体积的淋巴细胞分离液，室温2 000 r·min，离心15 min，用细的玻璃滴管吸取中间的白膜，生理盐水洗1遍后加入TRIzol裂解液混匀，提取细胞总RNA，然后逆转录为cDNA。将得到的cDNA模板用去离子水稀释5～10倍后用于Real-Time PCR，反应条件为95℃预变性30 s；95℃变性5 s；60℃延伸34 s，40个循环；熔解曲线反应条件95℃变性1 min，60℃复性1 min；应用 Applied Biosystems 7500 software分析数据。ABCB5引物为：上游5′-GCTGAGGAATCCACCCAATCT-3′，下游 5′-CACAAAAGGCCATTCAGGCT-3′；P-gp引物为：上游 5′-TGCTCAGACAGGATGTGAGTTG-3′，下游 5′-AATTACAGCAAGC CTGGAACC-3′；人 源 GAPDH 引 物 为：上 游 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′，下 游 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，由Invitrogen公司北京合成部合成。

1.3.8 统计学处理 数据以¯x±s表示，结果重复3次，显著性检验采用t检验。

2 结果

2.1 ABCB5及P-gp在急性髓系白血病细胞系KG1a细胞中高表达 采用FACS的方法，在蛋白水平上检测急性髓系白血病干祖细胞系KG1a细胞表面P-gp及ABCB5的表达，发现二者在KG1a细胞表面表达量均较高，阳性率都接近100%（Fig 1 AB，C-D）；若用荧光强度代表各自的相对表达水平，那么P-gp的表达量明显高于ABCB5（P＜0.01），为ABCB5的3.7倍。Western blot的方法分析结果与上述结果一致，ABCB5及P-gp在KG1a中均为特异高表达（Fig 1E）。

Fig 1 Expression of ABCB5 and P-gp in KG1a cellsThe relative expression of ABCB5 and P-gp on the surface of KG1a cells wasmeasured by FACS（A-D）.A：The isotype control for ABCB5；B：ABCB5 antibdoy；C：The isotype control for P-gp；D：P-gp antibody；E：The expression of ABCB5 and P-gp in KG1a cells was analyzed by Western blot.

2.2 siABCB5瞬时干扰降低KG1a中ABCB5的表达水平 特异的siABCB5转染KG1a 72 h后，提取细胞总蛋白，Western blot分析其蛋白表达水平，结果显示，与对照组（转染乱序siRNA）相比，siABCB5组ABCB5蛋白表达水平明显降低（Fig 1E），说明特异的siABCB5可以有效地干扰并降低ABCB5的表达。

2.3 ABCB5和P-gp共同参与介导KG1a对化疗药物的外排 外排泵P-gp和ABCB5可以利用水解ATP的能量将各种药物从细胞内转运到细胞外，使药物在细胞内浓度不断下降。Rho123是一种可以通过细胞膜的荧光染料，也是外排泵P-gp和ABCB5的底物，所以其可用于检测外排泵的功能；维拉帕米是外排泵抑制剂。KG1a的外排实验结果显示：外排泵抑制剂维拉帕米预处理后，KG1a细胞内Rho123荧光强度与未处理组相比明显增加（Fig 2 b-c）说明维拉帕米抑制外排泵P-gp和ABCB5的功能，从而增加了细胞内Rho123的蓄积；而干扰ABCB5组胞内Rho123蓄积量介于维拉帕米未处理组和处理组之间（Fig2 b-d），说明 P-gp和 ABCB5共同参与KG1a对化疗药物的耐受机制。

Fig 2 Intracellular rhodam ine 123 weremeasured by FACS to reflect function of efflux pumpa：A negative control for KG1a；b：KG1a cells；c：KG1a cells pretreated with verapamil as a positive control；d：siABCB5-KG1a cells；cell in b，c，d were incubated with rhodamine123 for90min respectively.

2.4 干扰ABCB5的表达可以提高KG1a对化疗药物的敏感性 维拉帕米对KG1a的EC50为（75.99±2.71）μmol·L-1（Fig 3A），我们选取对细胞生长无明显影响的剂量10μmol·L-1与化疗药物阿霉素联用，观察两者的联用效果。结果显示：单独阿霉素组 KG1a的 EC50为（5.8±1.4）μmol·L-1；而联用无毒剂量维拉帕米组，其EC50降低为（0.086±0.013）μmol·L-1，换言之，联用无毒剂量维拉帕米使KG1a对阿霉素的敏感性提高67.4倍；干扰ABCB5组其 EC50降低为（0.67±0.12）μmol·L-1，对阿霉素的敏感性提高8.6倍。

Fig 3 Sensitivity of KG1a or siABCB5-KG1a for ADR detected by MTTA：KG1a cells were exposed to various concentrations of verapamil for 72h to confirm a safe dose for KG1a；B：KG1a cells，KG1a cells pretreated with verapamil or si ABCB5-KG1a cells were exposed to various concentrations of ADR for 72 h.

Fig 4 ABCB5 gene expression in samples from AML and correlation between ABCB5 and MDR1 gene expressionA：The expression of ABCB5 in samples from AML and healthy donorswere detected by real-time PCR；B：The expression of ABCB5 in relapse/refractory and drug sensitive AML samples；C：The correlation between ABCB5 and MDR1 gene expression.**P＜0.01 vs PBL；＃＃P＜0.01 vs relapse/refractory.

2.5 ABCB5在AM L病人标本中高表达，并与MDR1的表达水平成正相关 检测71例来源于AML病人外周血单个核细胞中ABCB5的表达水平，结果显示其在AML病人细胞中的表达水平明显高于健康人外周血单个核细胞（P＜0.01）（Fig 4A）；其中，38例为复发或难治型病例，其余33例为化疗敏感型病例，而ABCB5在复发或难治型病例中的表达水平明显高于化疗敏感型（P＜0.01）（Fig 4 B）；另外，在38例复发或难治型病例中ABCB5的mRNA表达水平与MDR1的表达水平成正相关（Fig 4C）。

3 讨论

AML是以外周血、骨髓和（或）组织内的髓系原始细胞克隆性增殖为特征的异质性造血系统恶性肿瘤，是成年人最常见的急性白血病。尽管化疗和支持治疗的方法不断进展，多数患者经诱导化疗后可达到完全缓解，但一部分患者最终还会复发，5年总生存率仅为40%～50%［12］。而复发及难治的根源在于患者对化疗药物产生MDR，研究表明，AML患者中MDR1及蛋白表达产物P-gp通常是高表达的，并往往伴随着疗效差及预后不佳［4］。而临床上化疗药物联合针对P-gp的外排泵抑制剂的疗效并没有达到预期效果，如二代P-gp抑制剂valspodar或PSC-833，与化疗药物联用治疗复发或难治的AML没有明显提高缓解率及长期存活率［13-14］；仅有1例环孢素 A（P-gp竞争调节剂）的临床试验（SWOG9126）的结果显示：联用环孢素A的AML患者可以获得更长时间的存活［15］；而使用3代P-gp抑制剂zosuquidar，也并未明显延长患者生存时间或提高缓解率［7］。上述结果提示，介导AML的耐药机制可能不仅仅由于P-gp的参与，或许涉及更广范围的ABC超家族成员或其它耐药分子机制。本研究结果显示，除P-gp之外，有另一重要分子ABCB5参与介导AML的耐药现象：ABCB5在AML细胞系KG1a中高表达；而用siRNA的方法成功降低ABCB5的表达后，siABCB5-KG1a表现出外排功能减弱，胞内药物蓄积增多，从而提高其对化疗药物阿霉素的敏感性；另外，在71例来源于AML的临床标本中，ABCB5的表达水平明显高于健康组，其中复发和难治的白血病标本中ABCB5的表达量明显高于化疗敏感的病人标本，并且其ABCB5的表达水平与MDR1表达量成正相关。揭示了ABCB5与急性白血病的进展以及难治和耐药的关系，ABCB5可能成为针对AML耐药的新靶点。

ABCB5最早被发现参与调节表皮黑色素祖细胞的融合，同时与其它ABC超家族成员一样，也有外排泵的功能［8］，介导黑色素瘤［16］、结肠癌［10］等肿瘤细胞对蒽环类抗生素及紫杉醇类药物的耐受；另外，有研究［8-10］认为，ABCB5可作为恶性黑色素瘤肿瘤干细胞的标志，靶向ABCB5的治疗策略可以抑制肿瘤的形成，并且其在肿瘤形成、进展以及化疗耐药方面都发挥了重要作用。那么，ABCB5作为联系肿瘤干细胞、多药耐药以及肿瘤预后的一个重要分子，它将成为难治及复发肿瘤的一个潜在治疗靶点。而本研究结果成为上述结果的延续，我们发现，ABCB5与P-gp一样，在常见的血液系统疾病AML的耐药及复发中有重要作用，并且与病人预后密切相关。临床上单独靶向外排泵P-gp并未明显改善疗效，而这些结果提示我们针对ABCB5及P-gp双靶点或许能够改善AML病人的缓解率及长期存活率，这些有待进一步的研究结果支持。

综上所述，ABCB5参与介导AML的耐药及复发，并与P-gp的表达以及病人预后成正相关，为AML的临床治疗提供潜在的新的靶点。目前研究认为，AML的复发耐药是由于白血病干细胞的残留导致的，而本研究关于ABCB5与白血病干细胞的内在联系仍然未知，这也是我们今后深入研究的方向，为AML临床治疗奠定基础。

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