雪胆素乙诱导刀豆蛋白A刺激的小鼠淋巴细胞凋亡及其机制的研究*

胡 波， 施资坚， 王 遥， 刘坤鹏， 潘 浩， 尹良红△

(暨南大学1附属第一医院肾内科，2生命科学技术学院免疫生物学系，广东广州 510632)

雪胆素乙诱导刀豆蛋白A刺激的小鼠淋巴细胞凋亡及其机制的研究*

胡 波1， 施资坚1， 王 遥2， 刘坤鹏2， 潘 浩2， 尹良红1△

(暨南大学1附属第一医院肾内科，2生命科学技术学院免疫生物学系，广东广州 510632)

目的：分析雪胆素乙(CuIIb)对刀豆蛋白A(Con A)刺激的小鼠淋巴细胞体外凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法：以Annexin V染色结合流式细胞术分析小鼠淋巴细胞凋亡情况;利用JC-1染色分析淋巴细胞线粒体膜电位变化;Western blotting检测凋亡相关蛋白变化。结果：CuIIb处理后，早期和中期凋亡细胞比例明显增加，淋巴细胞线粒体膜电位降低。同时，CuIIb以剂量依赖方式激活caspase-3凋亡通路并明显降低抗凋亡蛋白survivin的表达。结论：CuIIb诱导淋巴细胞凋亡，其机制可能与其降低线粒体膜电位、激活caspase-3凋亡通路有关。

雪胆素乙;淋巴细胞;刀豆蛋白A

雪胆素乙(cucurbitacin II b，CuIIb)是从葫芦科雪胆属植物雪胆(Hemsleya amalils Diels)中提取的一种四环三萜类化合物，是葫芦素家族的一个成员，化学名为23，24-双氢葫芦素F［1］。自古以来，我国西南各民族用雪胆治疗菌痢、肠炎、支气管炎、急性扁桃体炎等炎症相关疾病。作为民族药，其具有清热解毒、抗菌消炎的功效［2-3］。雪胆块根中提取物制备为雪胆素片(含雪胆素甲和乙)已在临床用于治疗菌痢和肠炎等疾病，但其抗炎作用的机制尚不清楚。前文以刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)激活的小鼠淋巴细胞为模型［4］，发现CuIIb能有效影响淋巴细胞体外活化、增殖以及炎症因子的表达，但分子机制仍有待进一步研究。本研究以体外活化的小鼠淋巴细胞为模型，分析了CuIIb对活化小鼠淋巴细胞凋亡的影响，探讨其作用机制。

材料和方法

1 材料

清洁级BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，体质量(20±2)g，购自南方医科大学实验动物中心。CuIIb (纯度98%)，购自上海顺勃生物技术公司。Con A和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自Sigma-Aldrich。RPMI-1640、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、L-谷氨酰胺和β-巯基乙醇购自 Gibco/Invitrogen。5，5＇，6，6＇-tetrachloro-1，1＇，3，3＇-tetraethyl-benzimidazolcarbocyanine iodide(JC-1)和 RNase A购自Carlsbad。Annexin V-PE凋亡检测试剂盒购自Becton Dickinson。CuⅡb用DMSO配制成0.02 mol/L的储存液，-20℃保存待用。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、DNA双键断裂标志物H2AX(γ-H2AX)、多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶［poly-(ADP-ribose)polymerase，PARP］、Bcl-2、survivin等抗体均购自Cell Signaling。

2 方法

2.1 小鼠淋巴细胞分离培养 颈髓脱臼处死小鼠，无菌分离小鼠颈部、腋下以及腹股沟淋巴结，置于盛有预冷的PBS的无菌平皿中，除去被膜，以200目尼龙网滤过，收集的细胞用PBS洗涤2遍(1 500 r/min离心5 min)，用RPMI-1640完全培养基(25 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素、50 μmol/L β-巯基乙醇和10%FBS)调整细胞密度为2×109/L，接种于24孔板中(每孔500 μL)在37℃、5%CO2条件下培养。

2.2 Annexin V-PE染色 收集不同浓度CuIIb处理24 h的淋巴细胞，用冷PBS洗2次，将细胞重悬于100 μL 1×结合缓冲液，加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD，25℃ 避光放置15 min，再加入300 μL的结合缓冲液，立即上机分析。

2.3 JC-1染色检测线粒体膜电位 各实验组培养24和48 h后，离心收集细胞，弃上清，用500 μL培养基重悬细胞，加入500 μL JC-1工作液，JC-1终浓度为2.5 mg/L，细胞培养箱中37℃ 避光孵育20 min，离心，弃上清，冷 PBS洗涤2次，再加入冷PBS 300 μL，重悬细胞，上流式细胞仪检测。

2.4 免疫印迹 收集 CuIIb(5和10 μmol/L)处理24 h的小鼠淋巴细胞，用RIPA裂解细胞获得总蛋白［5］，随后取适量样品应用BCA试剂盒测量蛋白浓度。配制SDS-PAGE胶，每个样品上样40 μg蛋白，电泳后转移蛋白至PVDF膜。将膜转置5%脱脂牛奶室温封闭1～2 h，TBS+Tween洗膜3×5 min。加入以5%BSA稀释的I抗，置4℃摇床过夜。洗膜后再分别与相应的II抗(5% 脱脂牛奶稀释)室温孵育1 h，洗膜3次。最后用BeyoECL Plus化学发光试剂盒(碧云天)显色，X光片感光显影，FluorChem 800 (Alpha Innotech)成像仪记录结果并以Alpha EASE FC软件分析结果。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)，用GraphPad Prism 4.0软件进行单因素方差分析，组间比较采用Newman-Keuls检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 CuIIb引起活化的淋巴细胞凋亡

流式细胞术分析结果见图1，Con A刺激组凋亡细胞比例为39.92%，明显低于对照组;而2.5、5和10 μmol/L CuIIb均能明显增加凋亡细胞比例，与Con A组相比差异明显，并具有剂量依赖性。

2 CuIIb对小鼠淋巴细胞线粒体膜电位的影响

线粒体膜电位结果见图2，CoA组线粒体膜电位明显低于对照组(P＜0.01);而与 Con A 组(37.96%)相比，Con A+10 μmol/L CuIIb组线粒体膜电位(45.29%)显著上升 (P＜0.05)，而CuIIb浓度度为2.5和5 μmol/L时线粒体膜电位与CoA组差异不显著。

3 CuIIb促进小鼠淋巴细胞caspase-3的活化

免疫印迹结果表明(图3)，药物作用24 h后，10 μmol/L CuIIb能够明显促进caspase-3活化(即产生cleaved caspase-3)和γ-H2AX水平升高，表明在激活的淋巴细胞内，雪胆素乙诱导了DNA损伤。另外，PARP上升幅度不高，抗凋亡蛋白Bcl-2未受雪胆素乙处理的影响，而细胞周期调控的凋亡抑制蛋白survivin水平显著下调。这些结果表明，雪胆素乙通过诱导DNA损伤、抑制survivin表达来促进细胞凋亡。

Figure 1.CuIIb induced apoptosis of Con A-stimulated mouse lymphocytes.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs control group;＊＊P＜0.01 vs Con A group.图1 CuIIb引起活化的小鼠淋巴细胞凋亡

Figure 2.CuIIb induced cell apoptosis with reduced mitochondral membrane potential in Con A-stimulated mouse lymphocytes.Mean± SD.n=3.##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05 vs Con A group.图2 CuIIb对小鼠淋巴细胞线粒体膜电位的影响

Figure 3.Effects of CuIIb on the levels of cleaved caspase-3，PARP，phosphorylated H2AX(γ-H2AX)，Bcl-2 and survivin in Con A-stimulated lymphocytes.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs Con A group.图3 CuIIb对小鼠淋巴细胞凋亡相关蛋白及survivin表达的影响

讨论

淋巴细胞在适应性免疫应答中发挥核心作用，淋巴细胞的活化、增殖及促炎因子的释放等细胞行为是免疫应答的基础和关键事件，在免疫防御、免疫调节、炎症发生及自身免疫疾病中都发挥重要作用。本研究表明CuIIb能够诱导T淋巴细胞凋亡，并可能与CuIIb以剂量依赖方式影响凋亡相关蛋白的表达有关，提示CuIIb抗炎可能与其诱导淋巴细胞凋亡有关。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，能直接抑制caspase-3和caspase-7的活性，阻断细胞的凋亡过程。目前研究认为可能是通过以下途径实现的: survivin能与激活的caspase-3和caspase-7结合，阻止由 caspase激活剂或凋亡诱导剂诱导的细胞DEVD-cleaving自杀酶的积累，抑制了caspase的级联反应，从而阻止肿瘤细胞凋亡［6］;survivin也可通过p21间接抑制caspase，其机制可能为survivin与细胞周期调控因子CDK4形成survivin-CDK4复合体，使得p21从CDK4的复合体中释放出来，p21进一步与线粒体caspase-3结合，抑制其活性，阻止细胞凋亡［7］。我们的结果显示在Con A刺激活化的T淋巴细胞中，雪胆素乙处理后，淋巴细胞抗凋亡蛋白survivin的下调，促使caspase-3从复合体中释放，从而进一步提高其活化水平，促进了细胞的凋亡。

线粒体在诱导细胞凋亡中的作用已经被证实［8-10］。在特定凋亡诱导环境中，线粒体膜电位水平下调，导致膜通透性增加，启动凋亡相关的细胞色素C释放［11］，线粒体膜电位水平下调与线粒体依赖性的早期凋亡相关。另外，当DNA损伤发生，H2AX被快速磷酸化，并招募其它修复因子聚集在损伤部位，因此被作为DNA双链断裂的标志［12-13］。本文结果显示雪胆素乙处理细胞后会提高DNA双键断裂标志物γ-H2AX的水平，表明在淋巴细胞中，雪胆素乙诱导细胞凋亡是通过刺激DNA双键断裂来实现的。同时，体外培养的淋巴细胞会发生自发性凋亡，因此未经Con A刺激的淋巴细胞也表达较高水平的活化caspase-3和PARP。Con A刺激可使淋巴细胞增殖，因此ConA的刺激降低了淋巴细胞的自发凋亡。

综上所述，CuIIb能够明显促进体外培养Con A活化的小鼠淋巴细胞凋亡，并通过CuIIb剂量依赖方式激活caspase-3凋亡通路并下调抗凋亡蛋白survivin表达。

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Cucurbitacin IIb induces apoptosis of concanavalin A-activated mouse lymphocytes

HU Bo1，SHI Zi-jian，WANG Yao2，LIU Kun-peng2，PAN Hao2，YIN Liang-hong1
(1Department of Nephrology，The First Affiliated Hospital，2Department of Immunobiology and Department of Cell Biology，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510630，China.E-mail:yin-yun@126.com)

AIM:To explore the potential anti-inflammatory effect and the underlying mechanism of cucurbitacin II b(CuIIb)on concanavalin A(Con A)-activated mouse lymphocytes.METHODS:The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V staining.The change of mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 staining.The levels of caspase-3，phosphorylated H2AX and survivin were detected by Western blotting.RESULTS:Compared with Con A-activated lymphocytes，the significant increases in the proportion of the cells with reduced mitochondrial membrane potential or with increased Annexin V staining were observed，reflecting increased apoptosis in CuIIb plus Con A-treated cells.The increased levels of activated caspase-3 and phosphorylated H2AX(a marker of double-stranded DNA breaks)were manifested in Con A-activated cells co-treated with CuIIb.Although only a slight difference of cleavage of poly(ADP-ribose)polymerase was found in the cells with or without CuIIb treatment，the expression of survivin，an inhibitor of apoptosis protein，was markedly reduced by CuIIb in Con A-activated cells.CONCLUSION:CuIIb promotes apoptosis in mouse lymphocytes.

Cucurbitacin II b;Lymphocytes;Concanavalin A

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.021

1000-4718(2014)03-0509-05

2013-10-27

2014-01-10

科技部专项技术基金资助项目(No.2006AA02Z4D8)

△通讯作者Tel:020-38688502;E-mail:yin-yun@126.com