CRP在小鼠肺炎支原体肺炎模型中的表达及相关机制的研究

胡起波，许 忠，高 航，潘 薇，车广华＊

CRP在小鼠肺炎支原体肺炎模型中的表达及相关机制的研究

胡起波1，许 忠1，高 航2，潘 薇1，车广华1＊

（1．吉林大学第二医院儿科，吉林长春130041；2．吉林大学病理生物学教育部重点实验室，吉林长春130021）

目的 探讨CRP在小鼠肺炎支原体肺炎模型中的表达及相关作用机制。方法 建立小鼠肺炎支原体肺炎模型，分为对照组、模型组、治疗组，每组8只，按时间点处死后留取血清、肺及其他脏器组织，应用酶联免疫法、免疫组织化学技术及RT－PCR方法检测对照组、模型组、治疗组CRP的表达。采用SPSS11．5软件包进行统计学处理。结果 CRP在肺炎支原体肺炎的肺组织中呈高表达，与正常组、治疗组比较差异具有显著性（P＜0．05）。CRP在有肺外炎症的阳性表达强度明显高于无肺外炎症的组织中的表达，差异有显著性（P＜0．05）。酶联免疫法、免疫组织化学检测CRP蛋白阳性表达结果与RT－PCR的方法检测结果一致。结论 CRP在肺炎支原体肺炎中的表达高于其在正常组、治疗组中的表达；其阳性表达强度与肺炎支原体肺炎的炎症程度有关。CRP在有肺外炎症的阳性表达强度明显高于无肺外炎症的组织中的表达。CRP有可能参与了肺炎支原体肺炎的发生发展过程，为其诊断、肺外炎症的提示及合理治疗提供依据。

C反应蛋白；肺炎支原体肺炎；机制；小鼠

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0183）

肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是由肺炎支原体（MP）引起的肺部炎症，是一种常见的儿童获得性肺炎。近年来，肺炎支原体肺炎的发病率有明显增加的趋势。肺炎支原体是介于细菌和病毒之间的病原体，肺炎支原体在引起肺炎的同时也会导致各种肺外并发症，如脑炎、心肌炎、肝炎以及造血系统疾病等，已引起临床医师的高度重视。CRP是一种急性时相蛋白，因CRP不受性别、年龄、贫血和高球蛋白血症等因素影响，所以优于其他急性期反应物质。多数学者认为CRP是区别细菌和病毒感染的有效指标，但CRP在肺炎支原体肺炎中的表达情况及作用机制目前众说不一。

本研究应用酶联免疫法、免疫组织化学和RT－PCR方法从蛋白质及核酸水平上研究了CRP在小鼠肺炎支原体肺炎模型中的表达情况，探讨CRP在肺炎支原体肺炎中的相关作用机制，以期为肺炎支原体肺炎的临床诊断、肺外并发症的提示及治疗提供指导与依据。

1 材料和方法

1．1 菌株、主要试剂

肺炎支原体FH型标准株购于上海宝米科生物科技有限公司，PPLO培养基购于青岛海博生物技术有限公司，ELISA试剂盒购于上海蓝基生物公司，SP免疫组化试剂盒（KIT－9710）购于福州迈新生物技术开发有限公司。

1．2 实验动物

清洁级BALB／c小鼠，8－9周龄，体重20－25g，购于吉林大学白求恩医学院实验动物中心，均为雌性，共24只。按数字随机表法分为A－C共3组，每组8只。其中A、B组为实验组，C组为对照组。各组动物分笼饲养，实验组和对照组分房饲养，自由取食饮水，动物房保持恒温、恒湿，定期进行空气消毒。

1．3 MP标准株培养及MP菌数的测定（CCU实验） 见参考文献1。

1．4 感染MP及临床治疗

先将动物用乙醚吸入麻醉，然后用加样器吸取相应体积的MP菌液或生理盐水缓慢滴入小鼠的鼻腔。A、B组动物第0天接种含1×10－7ccu／ml的MP液各50μl；第5、8、9天接种含1×10－7ccu／ml的MP菌液各100μl。对照组以等量的培养基滴鼻接种。接种后每日观察各组动物的采食、饮水、活动度等情况变化。

A组动物于第11天起至第15天每天分别给予阿奇霉素10mg／Kg，皮下注射。

1．5 标本的采集

B、C组实验动物在11d处死，A组实验动物在20天处死。小鼠摘除眼球取血，无菌条件下取肺脏称重并取右中肺叶留作病原学检测，余肺及心脏、肾脏、脾脏、肝脏分成两份，一份用4%中性福尔马林溶液固定，经脱水、浸蜡、包埋，5μm连续切片后制成切片HE染色观察、进行组织病理学评分及免疫组化染色，另一部分保存于－80℃冰箱中，用于组织匀浆后提取组织总RNA进行RT－PCR检测目的基因CRP mRNA的表达水平。

1．6 小鼠肺组织病理学评分系统

每只小鼠的肺组织均被检测并计分，总分为0－26分。每张切片由5个分类评价系统组成，计算公式为：A分＋3（B分＋C分）＋D分＋E分［2］。

1．7 MP的病原学检测

［1］。

1．8 应用ELISA、免疫组织化学染色（S－P法）、RTPCR法测CRP的表达

严格按照说明书操作。

2 结果

2．1 小鼠肺炎支原体模型的建立及鉴定

2．1．1 成功培养肺炎支原体标准株，CCU值为10－7。

2．1．2 MP感染及治疗后小鼠的一般情况 小鼠接种后全部存活，C组小鼠进食、饮水、活动度等正常，状态良好。A、B两组小鼠在第1天精神状态略差，活动度降低，进食及排便减少，无咳嗽等呼吸系统症状，在第3天精神状态有所好转，鼻部出现少许分泌物，第6天，精神状态差，活动度降低，进食减少，大便略稀，鼻腔分泌物同前，但出现咳嗽、竖毛、寒战等症状，在第8、9天接种时乙醚麻醉后口鼻分泌物明显增加，进食与活动度明显低于对照组动物。经阿奇霉素治疗后小鼠精神状态逐渐好转，咳嗽等症状逐渐减轻、消失。进食、活动度逐渐恢复。

2．1．3 MP的病原学检测结果 A、B实验组肺组织匀浆培养管中液体MP检出率为100%，C对照组试管中液体排除MP的生长。经细胞壁染色后，各组标本的MP培养产物于光镜下观察均未见有明显细胞壁的杂菌存在。

2．1．4 小鼠肺组织及其他脏器病理学变化 ⓐHE染色显示对照组的肺组织结构正常（见图1）。模型组肺组织多呈中度或重度炎症改变（见图2），其中有两只小鼠肝脏呈轻度炎症改变（见图4），两只肾脏呈轻度炎症改变（见图5）。治疗组肺组织呈轻度炎症或无炎症（见图3），两只小鼠肝脏呈轻度炎症改变（见图6）。各组中心肌无明显炎症反应。ⓑ肺组织病理学评分 对照组（C组）评分为0－1分，模型组评分为5．2－17分，平均9．8分，治疗组评分为0－4．6，平均分2．8分。

2．2 ELISA检测CRP结果

表1 CRP检测结果（ng／mL，_x±s，n＝8）

2．3 免疫组织化学染色（SP法）结果

本研究选取8例正常小鼠、8例肺炎支原体模型、8例肺炎支原体模型治疗组的肺组织，应用免疫组织化学技术进行染色。CRP在正常组、模型组及治疗组中的表达见表2。

2．4 RT－PCR结果

2．4．1 CRP mRNA在正常对照组、模型组及治疗组肺组织中的表达 8例正常对照组组织中1例扩增出CRP目的片段，阳性表达率均为12．5%（1／8）。8例模型组组织中，7例扩增出CRP目的基因条带，阳性表达率为87．5%（7／8）。8例治疗组组织中，3例扩增出CRP目的基因条带，阳性表达率为37．5%（3／8）。CRP mRNA在正常对照组、治疗组、模型组肺组织的表达强度（相对系数）分别为0．457±0．126、1．256±0．324、2．405±0．378，CRP mRNA在正常对照组及模型组组织中的表达差异有显著性（P＜0．05），CRP mRNA在模型组及治疗组中的表达差异也有显著性（P＜0．05）。CRP mRNA的表达随着病理学炎症程度的增加而表达上调。

表2 CRP在正常肺组织、模型组肺组织及治疗组肺组织中的表达

图7 CRP mRNA在正常对照组、治疗组及模型组肺组织中的表达

3 讨论

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一种原核细胞型微生物，是能独立生活的最小、最简单的病原微生物。人群普遍易感，以年长儿多见。肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是儿童常见的呼吸道疾病，近年来，支原体肺炎发病率逐年增加。除引起呼吸道疾病外，MP还可引起心肌炎、肾炎、脑炎等许多呼吸系统以外的疾病，因而其早期诊断和治疗非常重要。

CRP属于急性时相反应蛋白，是在感染性疾病的早期机体受微生物入侵或组织损伤等炎性刺激时由肝脏合成的一种异常蛋白，在人体内广泛分布，CRP作为鉴别细菌性感染和非细菌性感染的经典试验，早已广泛应用，但CRP在肺炎支原体肺炎中的表达情况及能否作为肺炎支原体肺炎的诊断依据，目前众说不一，有文献报道在支原体感染时ELISA法测CRP及hs－CRP值显著升高，达77%及84．21%［3，4］，提示检测CRP可能对小儿支原体肺炎的诊断有重要的临床价值；也有研究提示在支原体感染患儿血中CRP升高者仅占37．5%、27%及32．58%，因此CRP不能作为支原体感染的一个敏感指标［5－7］。

本研究成功建立BALB／c小鼠的急性MP感染模型，并证实小剂量、间隔式的反复接种更适于小鼠MP感染的造模［1］，为进一步研究MP感染的发病机制和MP感染后机体免疫状态奠定了实验基础。

CRP在肺炎支原体肺炎中的表达高于在正常肺组织、治疗后的肺组织中的表达，其阳性表达强度与肺炎支原体肺炎的炎症程度有关，随病变程度的加重而增加。CRP在有肺外炎症的阳性表达强度明显高于无肺外炎症组织中的表达，如CRP增高明显或经合理治疗后降低缓慢应注意肺外病变的可能。CRP在心肌细胞中无明显阳性表达，可能与心肌损害较轻微、呈一过性，未引起明显病理改变有关。

CRP的产生主要受IL－1、IL－6、TNF－α的调节，三者在参与介导炎症反应、免疫调节等方面起着重要的作用。许多研究还提示CRP具有诱导效应细胞产生炎症因子的作用，Wang等发现用CRP刺激人血管内皮细胞能够明显诱导受刺激内皮细胞TNF－α的表达。炎症反应可诱导肝细胞产生CRP，CRP的升高又促进炎症因子TNF－α的产生，加重机体的损害。

综上CRP可能参与了肺炎支原体肺炎的发生发展过程，为其诊断、肺外炎症的提示及合理治疗提供依据。故临床检测CRP的动态变化对判断病情严重程度、治疗效果及预后有重要意义。

参考文献：

［1］杨 春．探讨接种时间和剂量对小鼠肺炎支原体肺炎模型建立的影响［J］．四川动物2009，28（4）：524．

［2］Martin RJ，Chu HW，Honour JM．Airway inflammation andbronchial hyperresponsiveness after mycoplasma pneumoniae infction in a murine model［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2001，24：577．

［3］董 琳，温怀凯，李昌崇．支原体肺炎血清急相蛋白水平变化及临床价值［J］．中国当代儿科杂志，2001，3（5）：54．

［4］程学文．超敏C反应蛋白检测在小儿支原体肺炎中的价值 ［J］．河北医药，2010，32（20）：2856．

［5］吴谨准，吴夏萍．白细胞分类．C反应蛋白在小儿肺炎支原体感染诊断中的意义探讨［J］．福建医药杂志，2007，29（5）：131．

［6］林志芳，贾 冰．白细胞和超敏C反应蛋白测定在小儿支原体肺炎中的临床意义［J］．检验医学与临床，2008，5（14）：849．

［7］李玉凤，莫润旺．C反应蛋白在小儿支原体肺炎中的测定及临床意义［J］．中国妇幼保健，2007，22（11）：1509．

The study on the expression and mechanisms of CRP in mouse model of mycoplasma pneumoniae pneumonia

HU Qi－bo，XU Zhong，GAO Hang，et al．（
The Pediatrics Department of the Second Hospital of Jilin University，Changchun 130041，China）

Objective To research CRP expression in MPP，evaluate there clinical significance and mechanism．Methods A mouse model of mycoplasma pneumonia pneumonia，control group，model group，treatment group each consisting of eight mice were established．Saving blood serum、lungs and other visceral organ，We detected the expression of CRP in control group，model group and treatment group by ELISA，immunohistochemistry and RT－PCR．Statistical treatment was carried out with SPSSll．5software package．Results CRP have a high expression in lung tissue of model group which is significantly different with the expression in control group and treatment group（P＜0．05）．CRP have an apparent higher positive expression in the mice that has extrapulmonary complication than doesn’t has it（P＜0．05）．With the detection of ELISA and immunohistochemistry CRP provided positive results．And it was highly consistent with RT－PCR．Conclusion CRP have a significantly higher expression in model group lung tissue than in control group and treatment group．Its expression intensity is related to the severity of MPP．CRP have significantly high expressions in the mice with extrapulmonary complication than those without．CRP might be involved in the development and progression of MPP．Provide theory and experiment basis for MPP clinical diagnosis，prompting extrapulmonary complication and treatment．

CRP；MPP；mechanism；mice

R563．1＋5

A

2013－01－20）

1007－4287（2014）02－0183－04

＊通讯作者