晚期结直肠癌患者DC－CIK免疫干预前后D二聚体改变的临床研究

王睿斌，郝筱诗，齐保聚，任连伟，盛敏佳

（1.北京市大兴区人民医院 肛肠外科，北京102600；2.吉林大学公共卫生学院2010级放射1班，长春130021；

3.吉林大学中日联谊医院 妇产科，长春130033）

恶性肿瘤患者往往伴有血液的高凝状态，这种高凝状态与恶性肿瘤的转移密切相关。化疗作为恶性肿瘤有效干预手段的同时，可加重这种高凝状态甚至形成血栓[1]。近年来，免疫干预对于肿瘤干预的有效性得到肯定，并且与单细胞测序、“普朗克”探测微波背景辐射、人类连接组计划、探索南极冰下世界、基础植物研究共同被列为2013年人类6大科技任务之一[2]。本实验的目的在于探讨DC－CIK免疫干预对于晚期结直肠癌患者凝血功能及D二聚体的影响，进一步肯定DC－CIK的有效性及安全性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2011年7月－2012年8月入住我院行DC－CIK免疫干预的IV期结直肠癌患者40人，其中男性26例，女性14例（年龄26－85岁），结肠癌15例，直肠癌25例（见表1）。所有患者在DC－CIK干预前后1月内均未接受放化疗。患者及其法定代理人知情并同意接受该干预。所有患者在G－CSF动员前5天内及DC－CIK免疫干预1个月后行凝血功能及D二聚体的检测。选择同期体检的健康成年人43例（年龄31－82岁）行凝血功能及D二聚体检测作为对照。

1.2 主要试剂来源

G－CSF为日本中外制药株式会社产品。干扰素－γ为上海凯茂生物医药有限公司产品，IL－2为北京四环生物制药有限公司产品，CD3单抗为北京同力海源生物技术开发公司产品，TNF－α、IL－4、GMCSF为厦门特宝生物股份有限公司产品。纤维蛋白原、凝血酶原时间、D二聚体检测试剂盒均为贝克曼库尔特有限公司产品。

1.3 凝血功能及D二聚体的检测方法

所有患者在G－CSF动员前5天内及DC－CIK免疫干预1个月后行凝血功能及D二聚体的检测。检测仪器为TOP全自动凝血仪，纤维蛋白原采用纤维蛋白原－C XL试剂盒，凝血酶原采用凝血酶原时间测定试剂盒（凝固法），D二聚体采用D－二聚体测定试剂盒（免疫比浊法）。

1.4 DC－CIK免疫干预经过

所有患者经骨髓穿刺细胞学检查证实无骨髓转移，骨髓造血功能大致正常，于－2天起予以G－CSF刺激造血，在－1天给予股静脉留置双腔ARROW静脉导管，－1、0、1天给于速碧林0.4ml皮下注射（共3天，分血后拔除股静脉置管，停止速碧林皮下注射）。当外周血白细胞﹥1×109／L、淋巴＋单核﹥15%后，分两天采集外周血干细胞200－250ml。取新鲜血25－50ml行DC－CIK细胞培养（剩余的－80℃分袋冻存备用）。培养7－10天进行细胞回输，最低细胞数量大于1×108，隔日1次，每周期3次。

1.5 DC－CIK细胞悬液的制备

取新鲜外周血干细胞25－50ml用生理盐水1∶1稀释，缓慢加入淋巴细胞分层液表面上，无菌封盖，400g，30min，轻轻吸细胞层，用生理盐水1 500 rpm，5min，洗3次。细胞计数后，5×106／ml／瓶，将细胞加入完全培养基（含2.5%自体血浆的1640培养基）中60－80ml／瓶，3瓶放入5%的CO237℃培养箱中培养2－4h。悬浮细胞进行CIK培养，贴壁细胞进行DC培养。然后检菌—将细胞与完全培养基进行细菌培养。

CIK培养：合并悬浮细胞培养液并移入完全培养基（含自体血浆的AIM－V），1LAIM－V培养基中加入各种细胞因子[干扰素－γ1ml（即全部加到1L AIM－V 中），IL－2 1 200μl，CD3单抗5－10μl并首次加1支肝素]，放入5%CO2培养箱中培养。

DC培养：贴壁细胞加入DC培养基和各种细胞因子[TNF－α（30μl／30ml），IL－4（60μl／30ml），GMCSF（60μl／30ml）]放入5%CO2培养箱中培养。

隔日镜下观察，根据细胞状态，补充完全培养基和细胞因子（含2.5%自体血浆 AIM－V加补IL－2终浓度1μl／ml）。

回收细胞后生理盐水低速离心，洗3次。用适量含有12.5%血浆蛋白的生理盐水重悬细胞，回输患者。

1.6 统计方法

所有数据均以平均值±标准差表示，配对t检验，采用SPSS 13.0软件包分析。

2 结果

2.1 DC－CIK细胞的流式检测结果

所培养的DC和CIK细胞以1∶3的比例混合，所得细胞总数大于1×108，图1为患者CIK细胞流式检测结果图例。

图1 某患者CIK细胞流式检测结果

2.2 晚期结直肠癌患者凝血功能与健康成年人的比较

所有晚期结直肠癌患者的D二聚体、FIB、PT%、INR均高于健康成年人（数据未显示）。

40例晚期结直肠癌患者在DC－CIK免疫干预1月后D二聚体水平仍高于健康成年人，并且差异有统计学意义（P＜0.05），FIB、PT%、INR也高于健康成年人，但差异无统计学意义（P＞0.05），详见表1。

表1 40例晚期结直肠癌患者免疫干预1月后与健康成年人凝血功能及D二聚体的比较

2.3 DC－CIK免疫干预前后凝血功能的比较

40例晚期结直肠癌患者在DC－CIK免疫干预前后D二聚体水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），FIB、APTT、PT%、INR也有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），详见表2。

表2 40例晚期结直肠癌患者DC－CIK免疫干预前后凝血功能及D二聚体的变化

3 讨论

恶性肿瘤患者往往伴有凝血功能异常——血浆纤维蛋白原增高[3]及D二聚体明显增高，这与肿瘤高负荷导致的过度纤溶有关[4]。肿瘤患者患静脉血栓的风险是健康人的7倍，而且是该人群的第二大死因[5]，甚至有日本学者报道D二聚体可作为晚期结直肠癌的独立不良预后因素[6]。化疗是肿瘤患者干预的重要手段，但化疗过程中肿瘤组织坏死产物及毒素对临近组织和血管造成损伤，可激活凝血过程，从而增加静脉血栓的风险[7]，临床上有待于发现一种有效并安全的干预手段。至2009年美国FDA批准了全球第一个免疫干预产品以来，人们对免疫干预对于肿瘤干预的有效性得到了肯定，我们的研究表明，DC－CIK免疫干预同时也可降低晚期结直肠癌患者D二聚体的水平，降低静脉血栓风险，和化疗相比更安全。

DC细胞是重要的抗原递呈细胞，在介导免疫细胞的抗肿瘤活性中起着非常重要的作用。CIK细胞是非组织相容性复合物和非T细胞受体限制性的免疫活性细胞[8]，既具有NK细胞的非 MHC限制性抗肿瘤作用也具有T细胞的抗肿瘤活性，抗瘤谱广。和单独培养的CIK细胞相比，DC－CIK的抗肿瘤活性更强，增殖速度更快并且凋亡速度更慢，CD3＋CD56＋细胞比例更高[9.10]，并且对多药耐药的肿瘤细胞的疗效更好[11]。

已有多篇文献报道术后联合DC－CIK、化疗联合DC－CIK 的有效性[12.13]，任军等[12]对比了转移性乳腺癌患者标准剂量紫杉醇加塞替哌方案化疗与大剂量该方案联合DC－CIK免疫治疗的PFS和OS，结果显示DC－CIK组与标准剂量化疗组相比，OS延长17.9个月（33.1比15.2），PFS延长6.5个月（10.2比3.7），差别均有统计学意义。本研究旨在探讨DC－CIK免疫干预在有效的同时对于凝血功能及D二聚体的影响。结果表明，干预后D二聚体明显下降（P＝0.005），说明DC－CIK免疫干预可大大降低患者的静脉血栓的风险，我们认为这与免疫干预后肿瘤负荷降低有关。我们的研究中患者在置管后及每日分血后均给于速碧林0.4ml皮下注射（仅3次），但根据速碧林的药代动力学，该药皮下注射后3小时血浆浓度达到高峰，而后5h进入半衰期，大约10－12h完全排出体外，故而对1月后的凝血功能及D二聚体没有影响。本研究中干预后患者的D二聚体水平仍然高于同期体检的健康成年人（P＝0.03），可能与干预后仍有一定肿瘤负荷有关。另外，干预前后FIB也有明显下降，但P＝0.067尚无统计学差异，我们不排除与样本量较少对结果的影响，随着研究的样本量进一步扩大尚待进一步观察。

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