吡非尼酮对大鼠肝细胞色素P450酶活性的影响

吴际,陈汇,吴健鸿,周顺长,曾繁典

(1.武汉科技大学城市学院,武汉 430083;2.华中科技大学同济医学院药理教研室,武汉 430030;3.武汉药品医疗器械检验所,武汉 430075;4.华中科技大学同济医学院动物实验中心,武汉 430030)

吡非尼酮对大鼠肝细胞色素P450酶活性的影响

吴际1,陈汇2,吴健鸿3,周顺长4,曾繁典2

(1.武汉科技大学城市学院,武汉 430083;2.华中科技大学同济医学院药理教研室,武汉 430030;3.武汉药品医疗器械检验所,武汉 430075;4.华中科技大学同济医学院动物实验中心,武汉 430030)

目的 阐明吡非尼酮(PF)对大鼠肝脏细胞色素P450总酶及其同工酶的影响。方法采用差示分光光度法测定大鼠肝微粒体总酶、二甲基亚硝胺N-脱甲基酶(NDMA)、红霉素N-脱甲基酶(ERD)的活性。SD大鼠56只,随机分为溶酶对照组、肝药酶诱导剂组、肝药酶抑制剂组,乙醇诱导组、吡非尼酮低剂量组、中剂量组和高剂量组。溶酶对照组给予1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na),诱导剂组0.5%地塞米松100 mg·kg-1,肝药酶抑制剂组1%酮康唑40 mg·kg-1,吡非尼酮低、中、高剂量组为PF25,50,100mg·kg-1灌胃给药,1日1次,连续6和12 d。取大鼠肝脏制备肝微粒体,测定肝微粒体中蛋白浓度,用分光光度计对样品进行比色。结果灌胃给药6 d后,吡非尼酮中、高剂量组(50,100 mg·kg-1)对P450总酶有明显的诱导作用,与溶媒对照组(1%CMC-Na)比较差异有统计学意义(P＜0.01);在给药6和12 d后,吡非尼酮对大鼠肝微粒体NDMA酶的活性影响不显著(P＞0.05),而对大鼠肝微粒体ERD酶具有显著的诱导作用(P＜0.01)。结论吡非尼酮中、高剂量组对大鼠肝药酶总酶及ERD酶具有诱导作用,且随着剂量和时间的增加,诱导作用增加。

吡非尼酮;细胞色素P450酶;酶活性

吡非尼酮(pirfenidone)是一种新型的广谱抗肺纤维化药物,其结构是5-甲基1苯基2(1氢)吡啶酮(5-methyl-1-phenyl-2(1H)-pyridone),能够防止甚至逆转纤维化发生和瘢痕形成,能抑制胶原的合成,减少多种细胞因子的产生,抑制成纤维细胞的增殖及其相应细胞因子的作用。本品系首个批准用于治疗特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的药物,我国已作为一类新药批准生产。笔者拟对吡非尼酮进行临床前药动学研究及对肝细胞色素P450酶(CYP)的影响,对该药临床应用的可行性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD大鼠,体质量200～240 g,雌雄兼有,购自武汉大学实验动物中心,许可证号:SCXK (鄂)2004-0004。

1.2 试药 吡非尼酮为上海睿星基因技术有限公司提供,含量＞99%,酮康唑(西安杨森制药有限公司,批号:010803649);醋酸地塞米松注射液(湖北天药药业股份有限公司,批号:030308),红霉素、二甲基亚硝胺、6-磷酸葡萄糖二钠、6磷酸葡萄糖脱氢酶、氧化型辅酶Ⅱ(NADP)均为Sigma公司产品,甲醛、乙酰丙酮、连二亚硫酸钠等为国产分析纯试剂,BCA试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司生产。

1.3 仪器 低温高速离心机(3-18K,Sigma公司);酶标仪(Elx 800);超低温冰箱(-86℃)(NCLAIR);721紫外-可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)。

1.4 分组与给药 SD大鼠共56只,分为7组,每组大鼠8只,雌雄各半。溶媒对照组[给予1%羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methyl cellulose,CMC-Na) 10 mL·kg-1];地塞米松药酶诱导组(给予0.5%地塞米松100 mg·kg-1);酮康唑药酶抑制组(给予1%酮康唑40 mg·kg-1);乙醇诱导组(给予50%乙醇5 mL·kg-1);吡非尼酮低、中、高剂量组(给予吡非尼酮25,50,100 mg·kg-1)。分别灌胃给药6,12 d后处死动物,取肝脏制备微粒体。

1.5 微粒体制备 采用钙沉淀法制备肝脏微粒体。肝脏组织匀浆后于2℃,10 000×g离心15 min,再取上清液与88 mmol·L-1氯化钙溶液混匀,冰浴5 min。2℃,27 000×g离心15 min,弃上清液,微粒体沉淀以0.25 mol·L-1蔗糖溶液重悬,-70℃保存备用[1]。

1.6 药物代谢酶测定 CYP含量的测定采用差示分光光度法。二甲基亚硝胺N-脱甲基酶(dimethyl nitrosamineN-demethylase,NDMA)活性和红霉素N-脱甲基酶(erythromycinN-demethylase,ERD)活性测定用分光光度法,二甲基亚硝胺和红霉素的终浓度分别为10 mmol·L-1和0.4 mmol·L-1。蛋白含量测定采用BCA试剂法[2]。

1.7 统计学方法 数据结果以均数±标准差(±s)表示,采用DAS ver1.0统计软件进行正态性检验、方差分析和Q值检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠CYP活性 结果见表1。CYP总酶方差分析见表2。组间两两比较见表3。从表1可见,给药6 d时,与溶媒对照组比较,地塞米松药酶诱导组可使大鼠CYP含量增加(P＜0.01),酮康唑药酶抑制组可CYP含量减少(P＜0.01)。吡非尼酮低剂量组CYP含量虽有增加,但差异无统计学意义(P＞0.05),当吡非尼酮剂量增加至50 mg·kg-1时则可明显增加CYP含量,表现为剂量依赖性。

2.2 大鼠肝微粒体NDMA酶活性 结果见表4。从表2可见,给药6 d时,中和高剂量吡非尼酮对大鼠肝微粒体NDMA酶活性无影响(P＞0.05),乙醇诱导组NDMA酶活性有诱导作用(P＜0.01)。给药12 d时,中和高剂量吡非尼酮对大鼠肝微粒体NDMA酶活性仍无影响。

2.3 大鼠肝微粒体ERD酶活性 结果见表5。从表3可见,给药6 d时,地塞米松诱导组可使大鼠肝微粒体ERD酶活性增加(P＜0.01),吡非尼酮中和高剂量组对大鼠肝微粒体ERD酶活性均有诱导作用(P＜0.01),同时吡非尼酮高剂量组诱导作用高于吡非尼酮中剂量组。给药12 d时,各用药组肝微粒体ERD酶活性进一步增加,吡非尼酮高剂量组诱导作用仍高于吡非尼酮中剂量组,表现出明显的剂量和时间依赖性。

表1 6组大鼠肝微粒体中CYP活性的测定值Tab.1 Determ ination results of CYP activity in liver microsome of six groups of the rats±s

表1 6组大鼠肝微粒体中CYP活性的测定值Tab.1 Determ ination results of CYP activity in liver microsome of six groups of the rats±s

与溶媒对照组比较,*1P＜0.01Compared with solvent control group,*1P＜0.01

?

表2 方差分析表Tab.2 Analysis of variance

3 讨论

肝微粒体CYP的含量测定一般采用经连二亚硫酸钠还原的肝微粒体悬浮液的一氧化碳(CO)差光谱计算。但是由于在标本收集时,很难用门静脉灌洗,所以在制备微粒体时混有较多的血红蛋白,在测定CYP的浓度时血红蛋白-CO复合物可干扰还原型P450-CO复合物的吸收光谱。为此,本实验用通CO微粒体悬浮液的连二亚硫酸钠差光谱计算,可消除血红蛋白对测定的干扰。

CYP是药物代谢酶系统中重要组成部分,参与药物或毒物的代谢,有200多种化合物可诱导CYP的产生,在肝微粒体中使CYP含量增加,另一些药物可抑制其活力,使肝微粒体中CYP产生减少[3]。本实验采用典型的CYP诱导剂地塞米松及抑制剂酮康唑进行实验,分别出现明显的CYP增加及减少效应,说明本实验的方法是可行的,其结果有可比性。

表3 肝微粒体中CYP含量测定组间统计分析(Q值)Tab.3 Intergroup statistical analysis on CYP content in liver microsomes

表4 吡非尼酮对大鼠肝微粒体NDMA酶活性影响的统计分析Tab.4 Statistical analysis on the effect of pirfenidone on NDM A activity of rat liver microsom es n=4,±s

表4 吡非尼酮对大鼠肝微粒体NDMA酶活性影响的统计分析Tab.4 Statistical analysis on the effect of pirfenidone on NDM A activity of rat liver microsom es n=4,±s

与溶媒对照组比较,*1P＜0.01;与乙醇诱导组比较,*2P＜0.01Compared with solvent control group,*1P＜0.01;Compared with alcohol-induced group,*2P＜0.01

组别剂量/ (mg·kg-1) 6 d活性/ (nmol·min-1·mg-1)诱导率/诱导率/ % 12 d活性/ (nmol·min-1·mg-1) %溶媒对照组…0.844±0.041…0.866±0.058…乙醇诱导组5mL·kg-12.245±0.056*161.5 3.676±0.100*175.5吡非尼酮中剂量组50 0.931±0.066*211.2 0.954±0.06*28.9高剂量组100 0.938±0.086*213.6 1.044±0.135*221.6

表5 吡非尼酮对大鼠肝微粒体ERD酶活性影响的统计分析Tab.5 Statistical analysis on the effects of pirfenidone on ERD activity of rat liver microsom es n=4,±s

表5 吡非尼酮对大鼠肝微粒体ERD酶活性影响的统计分析Tab.5 Statistical analysis on the effects of pirfenidone on ERD activity of rat liver microsom es n=4,±s

与溶媒对照组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05;与地塞米松药酶诱导组比较,*3P＜0.01Compared with solvent control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05;Compared with dexamethasone group,*3P＜0.01

组别剂量/ (mg·kg-1) 6 d活性/ (nmol·min-1·mg-1)诱导率/诱导率/ % 12 d活性/ (nmol·min-1·mg-1)%溶媒对照组…0.790±0.125…0.866±0.058…地塞米松药酶诱导组100 1.575±0.148*146.9 3.676±0.100*175.5吡非尼酮中剂量组50 1.128±0.119*2*326.6 0.954±0.06*38.9高剂量组100 1.261±0.060*2*313.6 1.044±0.135*2*321.6

CYP3型酶与体内一些内源性和外源性化合物的代谢有关,并可被类固醇、大环内酯类抗生素、抗真菌药物及苯巴比妥诱导。此亚型酶在体内占CYP总量70%,占肝内CYP 30%。在人体内,目前已发现4种CYP3A基因,即CYP3A3,CYP3A4,CYP3A5和CYP3A7,其中CYP3A4是在肝内含量较高,是人体内镇痛药芬太尼氧化代谢的主要酶[4]。红霉素N-脱甲基酶是一种CYP同工酶,测定此酶主要反映CYP3A的活性。

CYP2E1最早在兔肝微粒体中分离纯化出来,其特征为能被乙醇诱导,并被命名为P450LM3a,迄今发现所有CYP2E1的底物在人和动物中都是相同的,因此研究动物的CYP2E1对人具有重要参考意义。本实验通过测定NDMA酶活性来反映CYP2E1的活性。值得一提的是,大量的研究已证明,乙醇是一种典型的CYP2E1诱导剂。许多易挥发性麻醉剂的体内代谢都与CYP2E1有关(如氟甲氧氟烷、异丙氧氟烷、甲氧氟烷、二乙醚、三氯乙烯、三氧甲烷等);芳香族类化合物(如苯、对乙酰氨基酚、二甲基亚硝胺)的代谢也与CYP2E1有关[5]。KHARASCH等[6]研究发现此酶可被异烟肼等诱导。慢性乙醇中毒者可增强体内苯巴比妥、利福平等的代谢率,加快这些药物的排泄速度,认为此作用可能与CYP2E1被诱导有关;相反,急性乙醇中毒者又可能因乙醇竞争与CYP2E1结合,从而减慢上述同类药物的代谢速度。由于CYP2E1的活性存在个体和种族的差异,其底物主要是人们经常接触的前致癌物和前毒物,因此鉴定更多由CYP2E1催化代谢的药物和化学物质对于指导临床合理用药是必不可少的。

从统计分析结果可以看出,吡非尼酮中剂量组、高剂量组和溶媒对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),并且随着剂量的增加,CYP的含量也在增加;地塞米松和乙醇分别使药酶的活性大大增强(P＜0.01),吡非尼酮中、高剂量对CYP3A有显著的诱导性(P＜0.05),随着时间的增加诱导作用也会增强,而对CYP2E1则无影响(P＞0.05)。

[1] 徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2002:489.

[2] 张均田.现代药理实验方法(下册)[M].北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1998:1651-1652.

[3] JOHANNESEN K A,DEPIERRE JW.Measurement of cytochrome P450in the presence of large amounts of contam inating hemoglobin and methemoglobin[J].Anal Biochem,1978,86 (2):725-732.

[4] KHARASCH E D,THUMMEL K E.Human alfentanilmetabolism by cytochrome P4503A3/4.an explanation for the interindividual veaiebility in alfentanil clearance?[J]. Anesth Analg,1993,76(5):1033-1039.

[5] LIEBER C S.Cytochrome P4502E1:its physiological and pathological role[J].Physiol Rev,1997,77(2):517-544.

[6] KHARASCH E D,KARO M D,LANNI C,et al.Clinical sev of lurane metabolism and dispositionⅡ.The role of cytochrome P4502E1 in fluoride and hexafluoroisopropaol formation[J].Anesthesiology,1995,82(6):1379-1388.

DOI 10.3870/yydb.2014.06.008

Effect of Pirfenidone on Activity of Hepatic Cytochrome P450in Rats

WU Ji1,CHEN Hui2,WU Jian-hong3,ZHOU Shun-chang4,ZENG Fan-dian2
(1.City College,Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430083,China;2.Department of Pharmacology,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;3.Wuhan Institute for Drug and Medical Derice Control,Wuhan 430075,China;4.Animal Eχperimental Center,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

ObjectiveTo study the effects of pirfenidone on total enzyme and isoenzyme of liver microsomal cytochrome P450in rats.MethodsThe activites of liver microsomal dimethyl nitrosam ine N-demethylase(NDMA)and erythromycin demethylase(ERD)were determined.Fifty-six SD rats were random ly divided into six groups,in which they received CMC,dexamethasone 100 mg·kg-1,ketoconazole 40 mg·kg-1,pirfenidone 25,50,100 mg·kg-1,respectively.After administration for 6 and 12 days,liverswere prepared livermicrosome,the concentration of proteinum inmicrosome and shade selection to plasma samples were determined by spectrophotometer.ResultsAfter administration of pirfenidone for 6 days, cytochrome P450was significantly increased in 50 and 100 mg·kg-1pirfenidone groups,as compared with solvent control group (1%sodium carboxymethylcellulose)(P＜0.01).After administration of pirfenidone for6 and 12 days,NDMA of livermicrosome was not changed significantly(P＞0.05).ERD of livermicrosome was significantly increased in 100mg·kg-1pirfenidone group after administration for 12 days(P＜0.01).ConclusionPirfenidone can induce P450and ERD activities in a dose-and timedependentmanner.

Pirfenidone;Cytochrome P450;Enzyme activity

R965

A

1004-0781(2014)06-0723-04

2013-07-19

2013-12-21

吴际(1978-),男,湖北武汉人,讲师,硕士,从事临床药理研究。电话:(0)13871593295,E-mail:wuji003@outlook.com。

曾繁典(1939-),男,湖北京山人,教授,博士生导师,从事临床药理研究。电话:027-83693628,E-mail:fdzeng@163.com。