雷帕霉素对皮肤鳞癌细胞体外转移潜能的影响

郭思佳，查晓军，周海胜

雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是从吸水性链霉菌提取出来的一种新型大环类酯类免疫抑制剂［1］。它可与磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B／哺乳动物RAPA靶体蛋白（PI3K／AKT／mTOR）信号通路下游分子蛋白mTOR特异性结合，阻断该信号通路的刺激应答［2］。RAPA近年来一直是国内外的关注热点，许多研究已经发现RAPA有良好的抗肿瘤效果，包括乳腺癌、肺癌、肾癌等［3］，对肿瘤细胞的生长有很强的抑制作用。最近国外研究发现RAPA还可用于治疗阿尔采末病［4］，但对皮肤上皮鳞癌细胞的作用鲜有报道。

皮肤上皮鳞状细胞癌（鳞癌）是皮肤表皮细胞的恶性肿瘤，又称为皮样癌，常见于50岁以上的老年人，高发于头皮、面部、口舌等处，尤其是皮肤与粘膜交界处。发展快，对组织破坏力强，具有很强的侵袭性和迁移性［5］。临床治疗主要采用根治性切除手术，并联合术后放疗或化疗。但由于癌细胞的高侵袭性和高迁移性，易发生复发和转移，因此临床上的预后不良。而皮样癌的发病机制目前尚不清楚，有研究表明，可能由于Ras信号通路的激活，进而活化 PI3K／AKT／mTOR信号通路［6］，促进上皮细胞的过度增殖、迁移和脱（转）分化，同时导致了表皮屏障的增厚和功能障碍［7］。

本研究旨在观察RAPA对于上皮鳞癌细胞的作用，并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人上皮鳞癌细胞A431，中国协和医科大学细胞中心实验室刘德培教授惠赠。高糖DMEM培养基、胎牛血清、双抗均购自美国Hyclone公司。RAPA为美国Cell Signaling Technology产品（10μmol·L－1）。噻唑蓝 MTT购自碧云天公司。基质胶Matrigel为美国BD公司产品。Taq酶、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、DNA Marker均为中国大连宝生物公司产品。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。β-actin引物序列为：Sense：5′-TGGACATCCGCAAAGAC-3′，Antisense：5′-AAGGGTGTAACGCAACTAA-3′，PCR产物 302bp；OPN引物序 列：Sense： 5′-CATACAAGGCCATCCCCGTT-3′，Antisense：5′-ACGGCTGTCCCAATCAGAAG-3′，PCR产物59 bp。兔源抗OPN单克隆抗体、鼠源抗GAPDH单克隆抗体均为Abcam公司产品。Transwell嵌套为Corning产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 细胞培养用高糖DMEM培养基含10%的胎牛血清和1%青、链霉素（P／S），培养条件为5%CO2和37℃。

1.2.2 实验分组 实验分为Control（正常对照组）、RAPA处理组（5、10、20 nmol·L－1）。

1.2.3 MTT实验 取对数生长期的A431细胞，用10 g·L－1胰蛋白酶消化，并吹打成单个细胞，用DMEM制备成约为2×108·L－1的细胞悬液，按12、24、48、72 h 4个时间梯度准备4个96孔板，每孔加入100μl约2×104个细胞，待细胞贴壁后，在每个时间梯度按照预定的实验分组进行处理（每组设5个复孔），每孔加入10μl配制好的MTT溶液（5 g·L－1），在培养箱内继续孵育4 h后，每孔加入100μl的Formanzan溶解液，在培养箱内继续孵育，直至在光学显微镜下观察发现Formanzan全部溶解，在570 nm测定吸光度（OD）值。计算抑制率／%＝（对照组吸光度平均值－实验组吸光度平均值）／对照组吸光度平均值×100%，并作图。

1.2.4 划痕愈合实验 取状态良好的A431细胞铺板，铺匀细胞，待生长密度至90%时，换用1%低血清培养基培养，用10μl枪头划痕，同时在RAPA处理组中加入适当浓度的RAPA。37℃继续培养，按0、12、24、36、48 h时间梯度观察并拍照，重复 3次。

1.2.5 Transwell侵袭实验 A431细胞饥饿24 h，用10 g·L－1胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液，用含0.1%BSA的无血清培养液重悬细胞，稀释成2×108·L－1，取出 1 ml细胞悬液，加入 1μl浓度为10μmol·L－1的 RAPA，使之终浓度为 10 nmol·L－1，在每个Transwell上室加入200μl细胞悬液，正常对照组加入等体积培养液。每组设5个复孔，重复2次。在下室中加入600μl含5%胎牛血清的培养基，37℃继续培养24 h，HE染色，显微镜下观察，并计数。

1.2.6 RT-PCR 接种A431细胞于6孔板，细胞贴壁后，依据MTT实验筛选出的药物浓度处理细胞，并按12、24、36、48 h收集细胞，提取各组细胞总RNA，按照试剂盒说明书进行逆转录，再通过PCR方法检测目的基因表达水平。PCR体系为：模板3 μg，Ex Tag酶 0.25μl，10×Ex Tag Buffer 2.5μl，dNTP Mixture 2μl，上下游引物各 1μl，再加入dH2O使终体系终体积为25μl；PCR条件（三步法）是94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s（30个循环）；72℃ 7 min。

1.2.7 Western blot 接种A431细胞于12孔板，贴壁后，依据MTT实验筛选出的药物浓度处理细胞，并按12、24、36、48 h时间梯度收集细胞，用 PBS清洗3次，加入适量事先37℃预热10 min过的细胞裂解液，冰上裂解20 min，用1 ml枪头刮下细胞，100℃水浴锅裂解10 min，随后进行10%SDS-PAGE电泳，后采用恒流170 mA湿转2 h，使蛋白转移到PVDF膜上，封闭40 min后（封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST溶液），按1∶1 000稀释的一抗并孵育，次日洗膜，按1∶5 000稀释的二抗并孵育，12 h后洗膜，暗室曝光显影。

1.3 统计学分析 利用IBM SPSSStatistics19.0软件对数据进行处理，实验数据以¯x±s表示，不同组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 RAPA对A431细胞增殖的影响 为研究RAPA对A431细胞增殖能力的影响，采用MTT法检测不同浓度RAPA对鳞癌细胞A431增殖活性的抑制率，结果显示（Fig 1）：5、10及 20 nmol·L－1RAPA分别处理A431细胞，其增殖的抑制率均明显升高（P＜0.05）；与10 nmol·L－1相比较，利用 20 nmol·L－1处理A431细胞时，细胞增殖抑制率变化无统计学意义（P＞0.05）。拟选用10 nmol·L－1RAPA处理A431细胞进行后续试验。

Fig 1 Proliferation inhibitory rate of A431 cells treated by RAPA at different concentrations（5，10，20 nmol·L－1）

2.2 RAPA对A431细胞迁移的影响 为了研究RAPA对A431迁移能力的影响，选择10 nmol·L－1RAPA处理A431细胞0～48 h，进行划痕实验（Fig 2A）。A431细胞在划痕后48 h内有明显迁移现象，而经过RAPA处理的A431细胞，迁移现象明显减弱。利用Wimasis GmbH计算其划痕面积，按¯x±s，并作图（Fig 2B）。与对照组相比，RAPA组的划痕面积在24 h后，A431细胞迁移率差异具有显著性（P＜0.05）。

2.3 RAPA对A431细胞侵袭能力的影响 Transwell实验检测鳞癌细胞A431经RAPA处理前后侵袭能力的变化（Fig 3）。结果显示：对照组A431细胞穿透基质膜的细胞数（14.8±1.25），提示A431具有一定的侵袭能力；而经过RAPA处理的A431细胞，穿透的细胞数明显减少（3±1.27）。与对照组相比，穿膜细胞数差异具有显著性（P＜0.05）。

Fig 2 Migration of A431 cells treated with RAPA（10 nmol·L－1）

2.4 RAPA对A431细胞中OPN的表达影响 为了研究RAPA抑制A431细胞的迁移和侵袭是否与抑制OPN的表达有关，选用10 nmol·L－1RAPA处理细胞，在作用12、24、36、48 h后，分别收集各时间点的细胞提取细胞总RNA和总蛋白。利用RT-PCR和Western blot分别在mRNA水平和蛋白水平检测细胞中OPN的变化。随RAPA作用A431细胞的时间增加，RT-PCR结果显示OPN的mRNA丰度逐渐降低（Fig 4A）；同时Western blot的结果也显示OPN蛋白逐渐降低（Fig 4B）。

3 讨论

Fig 3 Invasion of A431 cells treated by RAPA（10 nmol·L－1）

Fig 4 The expression of OPN in A431 cells treated by RAPA（10 nmol·L－1）

肿瘤细胞中的mTOR信号转导通路，依靠其结构和功能的特异性，通过调控细胞周期蛋白表达水平，调节细胞周期和细胞的迁移侵袭，进而调控肿瘤细胞的生长及转化方向［8］。RAPA是mTOR特异性抑制剂［9］，最初作为一种新型的大环类酯类免疫抑制剂应用于临床。但是近年来，越来越多的研究证实RAPA具有治疗肿瘤的潜能［10］：如RAPA明显抑制乳腺癌细胞的增殖及侵袭迁移、减少肝癌细胞血管内皮生长因子（VEGF）的分泌，抑制肿瘤血管生成。本研究为探讨RAPA对人皮肤鳞癌细胞的影响，采用MTT方法观察其抑制癌细胞的增殖作用。结果显示使用不同浓度的RAPA作用于A431细胞后，可以有效抑制人上皮鳞癌细胞A431的增殖，且抑制率呈浓度依赖性。

肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力是肿瘤转移的关键因素之一，抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭能力已经成为该领域的研究热点之一。为证实RAPA是否具有抑制皮肤鳞癌细胞的迁移和侵袭能力，使用RAPA处理A431细胞进行划痕实验，结果显示划痕愈合距离较对照组细胞明显减少；说明RAPA可以有效抑制A431迁移；Transwell实验结果显示RAPA处理的透膜细胞较对照组明显减少（P＜0.05），同时证实RAPA可以降低A431细胞的侵袭能力。OPN作为细胞基质蛋白家族成员，在上皮肿瘤的发生发展中，尤其是促进上皮细胞迁移和侵袭，都起到了重要作用［11］。研究证实 PI3K／AKT／mTOR信号通路的活化可以增加OPN的表达，从而促进细胞的迁移和侵袭［12－13］。RT－PCR和 Western blot的结果均显示在RAPA处理后的A431细胞中OPN的表达均下降。其分子机制可能是RAPA通过抑制PI3K／mTOR信号通路，降低了OPN的表达，进而抑制A431细胞的迁移和侵袭。

RAPA作为mTOR的特定靶向抑制剂，体外实验证实其可以抑制鳞癌细胞A431的增殖、迁移及侵袭，从而为应用于上皮鳞癌临床治疗提供理论依据。但其抑制的作用结合位点，如整合蛋白受体（α9β1、α4β1、αvβ3、αvβ5）和跨膜蛋白 CD44及其相互作用的分子机制有待进一步研究［14－15］。

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