五味子乙素对UVB辐射诱导HaCat细胞凋亡的抑制作用及其机制

曹 波，牛 聪，卢 涛，胡 杰，陈 虹，3

由于各种因素导致大气臭氧层的不断破坏，致使太阳紫外线辐射明显增强。紫外线按其波长的不同可以分为 4种，长波紫外线（UVA，320～420 nm）、中波紫外线（UVB，290～320 nm）、短波紫外线（UVC，200～275 nm）和真空紫外线（UVD，100～200 nm），研究表明UVB到达地面的量最大，且对人体的危害最大。长期或大量的基础紫外线照射能导致皮肤表皮细胞凋亡相关基因表达的变化，严重者可造成细胞DNA的损伤并导致细胞癌变［1－3］。

天然产物中的许多成分具有抑制凋亡的作用［4］，可以对抗UVB对机体的损伤。我们前期用人表皮角质永生化细胞（HaCaT）制造UVB损伤模型，并筛选了多种天然产物，发现五味子乙素（SchB）、槲皮素（quercetin）、芸香苷（violaguercitrin）具有较好的UVB防护作用。在此基础上本文选择SchB作为研究对象，探究其对UVB辐射诱导的HaCaT细胞凋亡的抑制作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人永生化角质细胞HaCaT细胞购自凯基生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂和仪器 五味子乙素（SchB），由本院生药学教研室陈虹教授研究室提供，分子质量400，白色结晶，难溶于水，纯度97%，体外实验用DMSO配制。DMEM培养基（天润善达公司），胎牛血清（FBS）（中国医学科学院血研所科技公司），溴化四 氮 唑 蓝 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl-tetrazolium Bromide，MTT）、Hoechst 33342、EB（溴化乙啶）（美国Sigma公司），RT-PCR试剂盒（大连宝生物资源有限公司），Olympus IX70倒置显微镜（日本 Olympus公司），MODEL680型酶标仪（意大利BIO-RAD公司），UV-260型紫外－可见分光光度计（日本Shimadzu公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人表皮角质永生化细胞HaCaT。在DMEM培养基中（含10%胎牛血清，100 kU·L－1青霉素、100 mg·L－1链霉素）培养。

1.2.2 MTT法检测 取对数生长期等量细胞接种于96孔细胞培养板。接种24 h后，用中波紫外线（UVB）段紫外光疗仪（Waldman，Schwenningen，German）辐射板中细胞，辐射剂量为30 mJ／cm2（辐射密度2 mW／cm2，辐射时间150 s），之后加入不同剂量的 SchB及维生素 E（vitamin E）（10、1、0.1、0.01 μmol·L－1），阴性对照组加入等量溶媒，放置 37℃，5%CO2培养箱24 h后，每孔加入50μl 1 g·L－1MTT溶液，37℃孵育，4 h后弃去上清，每孔加入DMSO 150 μl，测定光密度值（OD），并计算 IC50值［5］。

1.2.3 Hoechst染色 通过Hoechst 33342染色来观察UVB（30 mJ／cm2）辐射后及给药后细胞形态变化及细胞凋亡状况。收集及固定细胞完成后，用PBS冲洗HaCaT细胞3次，室温避光，Hoechst 33342（10 mg·L－1）染色10 min。通过 CHK型光学显微镜观察，Olympus数码相机照相。

1.2.4 SchB对HaCaT基因表达的影响 取对数生长期等量接种于6孔细胞培养板。接种24 h后，UVB（30 mJ／cm2）辐射板中细胞，加入 10μmol·L－1SchB，分别在 4、8、12和 24 h后收集细胞，用TRIzol法提取总RNA。按RT-PCR试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。PCR分析：β-actin作为内标，靶基因为p21（引物序列为5′-TGT CCG TCA GAA CCC ATG CG-3′和 5′-GCG AGG CAC AAGGGT ACA AG-3′），p53（引物序列为 5′-TCT GGG ACA GCC AAG TCT GT-3′和 5′-GGA GTC TTC CAG TGT GAT GA-3′），Caspase-3（引物序列为 5′-GTG GAA TTG ATG CGT GAT G-3′和 5′-GGA ATC TGT TTC TTT GCA TG-3′）。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.2.5 统计学分析 实验数据用¯x±s表示，SPSS 13.0软件进行分析。

2 结果

2.1 MTT法检测SchB对HaCaT细胞的作用由Tab 1观察可知，五味子乙素和维生素E在0.01～10μmol·L－1范围内对 HaCaT细胞均无毒性。Tab 2可观察到，SchB可以明显减少紫外线照射后HaCaT细胞的死亡率，且具有一定的量效关系，说明其具有较强的紫外防护作用。

Tab 1 Cytotoxic effect of extract on HaCaT（¯x±s，n≥3）

Tab 2 Protective effect of schizandrin B and vitamin E against UVB-induced oxidative damage to HaCaT（¯x±s，n≥3）

2.2 Hoechst染色 我们通过Hoechst 33342染色可以明显的观察到HaCaT细胞的凋亡情况。UVB（30 mJ／cm2）辐射后细胞凋亡，Hoechst 33342染色后HaCaT细胞细胞核呈现凝聚染色质、细胞核皱缩。如Fig 1所示，UVB辐射后细胞凋亡明显增加，给药后细胞凋亡明显得到抑制。

Fig 1 Effect of SchB on HaCaT cells nuclear morphology：Hoechst 33342 staining

2.3 SchB对HaCaT基因表达的影响 经不同浓度的SchB作用于HaCaT细胞4、8、12、24 h，SchB降低了紫外诱导的p53、p21、Caspase-3等与凋亡有关基因的表达；表明SchB从抑制凋亡方面作用于细胞，有效的保护了细胞内胶原的含量，见Fig 2。

UVB照射后4～24 h，各组p21 mRNA表达量差异均无显著性；在UVB照射后4～12 h，加药组与对照组p53 mRNA差别存在显著性，而Caspase-3 mRNA则只在4 h时差异存在显著性；在UVB照射后24 h，加药组与对照组p53 mRNA差异无显著性，而Caspase-3 mRNA差异存在显著性。p53、Caspase-3 mRNA有随时间变化而升高的趋势，且对照组（Control）p53、Caspase-3 mRNA含量均高于其它组，见 Tab 3～5。

Fig 2 Effect of schizandrin B on p21，p53 and Caspase-3 mRNA expressions in HaCaT Cells

3 讨论

近年来，长期大量的接受UVB照射后导致的皮肤损伤包括日光性皮炎、光老化、皮肤癌变、免疫抑制等逐年增加［6－7］。UVB照射后的皮肤损伤的机制及如何预防和治疗UVB损伤是目前研究的重点。本实验室前期利用体外UVB损伤模型筛选了一系列天然产物，并对UVB损伤机制进行了初步探讨。发现天然产物SchB具有良好的抗UVB辐射作用。

Tab 3 Effect of schizandrin B on p21 mRNA expression in HaCaT cells（¯x±s，n≥3）

Tab 4 Effect of schizandrin B on p53 mRNA expression in HaCaT cells（¯x±s，n≥3）

Tab 5 Effect of schizandrin B on Caspase-3 mRNA expression in HaCaT cells（¯x±s，n≥3）

文献报道显示，UVB照射能够促进角质细胞形成环丁烷嘧啶二聚体（cyclobutane pyrimidine dimers，CPDs）、积累p53以及分泌炎症因子，从而导致皮肤表皮的主要效应细胞凋亡［8］。因而如何减少UVB照射后皮肤表皮细胞的凋亡是抗UVB辐射的一个重要靶点。本研究发现不同剂量的SchB（0.01～10μmol·L－1）均可以明显减少 UVB照射后HaCaT细胞的死亡率。Hoechst 33342荧光染色实验可以观测到模型组（UVB照射组）出现了核的固缩、边集和凋亡小体等典型的细胞凋亡特征，而在不同剂量的SchB组，可以观察到这些现象明显减少，这一结果说明了SchB可以抑制UVB照射后HaCaT细胞的凋亡。

p53作为一种重要的抑癌基因，可以明显的影响细胞的增殖与凋亡。研究结果显示，p53的累积是UVB辐射导致细胞凋亡和皮肤癌产生的重要标记物之一［9］。本文利用RT-PCR分析了UVB照射后不同时间点p53 mRNA的表达，结果表明在4 h p53的表达量开始增加，SchB（10μmol·L－1）组在4～12 h可以明显降低p53表达，与对照组比较具有统计学意义，说明SchB可能通过抑制p53的表达减少UVB辐射后的细胞凋亡。

p21作为p53基因下游的细胞周期调控因子，在细胞周期、DNA修复及细胞凋亡方面起着重要作用［10－12］。本实验分析p21基因，结果显示在紫外线辐射后4～24 h，细胞内p21各组变化不大，说明UVB辐射对细胞内的p21影响不大或是SchB对p21的作用较小。

Caspase-3作为细胞内凋亡的最终执行者，可以启动细胞的凋亡程序。研究表明大剂量的UVB照射皮肤后会诱导皮肤表皮细胞发生凋亡，从而导致皮肤光老化［13］。本研究发现UVB辐射后4～24 h后表皮细胞内Caspase-3表达明显增高，说明UVB照射启动了细胞内的凋亡通路。同时观测到高剂量的SchB组在4～24 h均可明显降低细胞内Caspase-3表达量。这一结果提示SchB在初期即可抑制细胞内Caspase-3的表达。其作用机制可能是SchB抑制了UVB辐射后凋亡基因Caspase-3的升高，进而抑制了UVB导致的细胞凋亡。

本研究发现UVB损伤模型中，凋亡相关基因p53和Caspase-3表达明显改变，而p21基因表达基本没有发生变化，这一结果与既往文献报道不完全一致，有待进一步研究［11－12］。

综上所述，SchB通过调节细胞凋亡基因的表达，抑制UVB对皮肤细胞的损伤。可将SchB研制成一种高效的紫外防护剂或者添加剂，广泛的应用于天然防护剂及化妆品中，为维护人类健康提供新的天然保障。

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