连杖微乳的制备工艺

林丽,银杉杉,刘磐,朱莉,陈威,林吉,张军

(1.广州中医药大学新药开发研究中心,广州 510006;2.广东药学院,广州 510006;3.广州医药研究总院有限公司,广州 510240)

连杖微乳的制备工艺

林丽1,银杉杉1,刘磐1,朱莉2,陈威3,林吉1,张军1

(1.广州中医药大学新药开发研究中心,广州 510006;2.广东药学院,广州 510006;3.广州医药研究总院有限公司,广州 510240)

目的 制备含茶油连杖微乳,并对其质量进行初步评价。方法采用滴定法绘制伪三元相图优选处方,以单因素实验优选工艺参数,并初步考察微乳的理化特性。结果微乳处方为:黄连提取物∶虎杖提取物∶茶油∶聚氧乙烯-35-蓖麻油∶丙二醇∶水的质量比为1∶1.4∶1∶7∶7∶21,75℃条件下,1 400 r·min-1搅拌20 min,微乳平均粒径为30.9 nm,粒径分布均匀,经高低温实验及加速实验仍然澄清透明,未出现相分离、沉淀和浑浊等现象。结论连杖微乳制备工艺简单,性质稳定。

连杖微乳;制备工艺;质量评价

中药烧烫伤制剂多为油剂,极性较大的有效成分难溶于油中,导致其中有效成分含量较低,无法满足临床需要。微乳作为新型药物载体,是一种热力学和动力学均较稳定的分散体系,粒径小(10～100 nm),对水溶性、脂溶性及难溶性药物均有较好的溶解能力,近几年来在药学上应用越来越广泛[1-2]。连杖复方由黄连、虎杖、茶油等组成。黄连中的盐酸小檗碱、表小檗碱、巴马汀、黄连碱有抑制金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、铜绿假单胞菌、真菌等药理作用,保证了创面的再修复[3-4]。虎杖中的二苯乙烯类物质如白藜芦醇及虎杖苷具有抗菌、抗氧化、抗休克、抗血小板凝聚、改善微循环等作用[5-6]。茶油有清热解毒、除腐生肌、抗炎止痒、护肤养颜的功效[7]及抗氧化、抗菌、促进组织修复等作用[8]。由于茶油等植物油的乳化困难,含有茶油等植物油的中药复方微乳体系鲜见报道。笔者采用微乳技术,构建含有黄连、虎杖醇提物及茶油的微乳体系,并对其稳定性、粒径进行考察,以期为开发安全、有效、使用方便的烧烫伤制剂奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪(UV检测器,LC-20AT泵,SIL-20A自动进样器,Labsolution色谱工作站);78-1型恒温磁力搅拌器(上海乔跃电子有限公司);高速离心机离心机(型号HC-3018,安徽中科中佳科学仪器有限公司);1000 HSA激光粒度仪(英国马尔文公司);万分之一分析天平(Mettler Toledo CP225D);十万分之一分析天平(Mettler Toledo AB204-N);旋转蒸发仪(EYELA SB-1000);KQ5200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声设备有限公司)。

1.2 试药 聚乙二醇硬脂酸酯15(HS15,批号: 16087036W0),聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH-40,批号: 79062488Q0),PEG-60氢化蓖麻油(RH60,批号: 43057368R0)均为德国巴斯夫股份有限公司;茶油(江西恩泉油脂有限公司,药用级,批号:101123);曲拉通X-100(OP,批号:38632)、聚氧乙烯-35-蓖麻油(EL-35,批号:J1218047)为阿拉丁试剂上海有限公司提供;聚山梨酯80(TW80)、1,2-丙二醇、聚乙二醇400 (PEG400)、丙三醇均为天津市大茂化学试剂厂;黄连提取物(75%乙醇提取物)、虎杖提取物(80%乙醇提取物),均为自制;盐酸小檗碱对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110713-200911,规格:20 mg);虎杖苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111575-200502,规格:20 mg);色谱甲醇、乙腈(Merck),水为自制超纯水,其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 处方的确定

2.1.1 不同溶剂对盐酸小檗碱和虎杖苷的溶解能力考察 在温度25℃条件下,将足量黄连提取物及虎杖提取物分别加入含有适量溶媒的试管中,并分别加入乳化剂(EL-35、RH-40、RH-60、HS15、TW80、OP)和助乳化剂(PEG400、1,2-丙二醇、丙三醇)。密封后将试管于涡旋混合器上涡旋20 min,使药物充分溶解。取出,微孔滤膜(孔径0.45 μm)滤过,取续滤液适量,精密称定,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得。采用高效液相色谱(HPLC)法分析黄连、虎杖提取物中指标成分盐酸小檗碱与虎杖苷的溶解情况,进而判断黄连、虎杖提取物在不同溶剂中的溶解性能,为乳化剂与助乳化剂的筛选提供参考,结果见表1。

表1 黄连提取物及虎杖提取物在各溶剂的溶解度Tab.1 SolubilityofCoptisrootandPolygonumcuspidatumextract in different adjuvants mg·g-1

由考察结果可知,不同溶剂对黄连提取物的溶解能力为:1,2-丙二醇＞PEG400＞丙三醇＞TW80＞HS15＞RH40＞EL35＞RH60＞OP。不同辅料对虎杖提取物的溶解能力为:1,2-丙二醇＞PEG400＞丙三醇＞OP＞TW80＞EL35＞HS15＞RH40＞RH60。

2.1.2 油相和助乳化剂的初步选择 根据茶油及复方微乳中药物黄连提取物、虎杖提取物的有效成分特性,茶油既可作为药物,又可作为油相,为减少辅料,直接选用茶油作为油相。

助乳化剂(cosurfactant,COS)可以辅助溶解药物和乳化剂,进一步降低表面张力,同时可以增大乳滴界面膜的柔顺性,促进曲率半径很小膜的形成[9]。由黄连提取物及虎杖提取物在不同辅料中的溶解性能考察可知,1,2-丙二醇对盐酸小檗碱、虎杖苷均有较大溶解度,因此选择1,2-丙二醇作为COS。

2.1.3 乳化剂的筛选 乳化剂是形成微乳的基本物质,其主要作用是降低界面张力形成界面膜,促使微乳形成。较为常用的有聚氧乙烯型、聚山梨酯类等[9]。本实验结合上述溶解度实验的测定结果外,还需考察乳化剂对茶油增溶量。因此考察EL-35、RH40、RH60、HS15、TW-80、OP等6种乳化剂对茶油的增溶量,筛选最佳乳化剂。

首先配制3 g表面活性剂的水溶液(其中乳化剂的质量占20%,1,2-丙二醇的量为20%)。再将表面活性剂的水溶液置于(25.0±0.5)℃恒温水浴锅中,移液枪逐滴(每滴10 μL)加入油相,直至溶液浑浊[10]。茶油在6种表面活性剂中的增溶效果见表2。

表2 茶油对6种表面活性剂增溶结果Tab.2 Solubilization of tea oil on six surfactants

由考察结果可知,6种乳化剂对茶油增溶量考察结果为:EL35＞RH40＞HS15＞RH60＞TW80、OP。

2.1.3.1 伪三元相图筛选乳化剂 由乳化剂对茶油增溶量考察结果可知,EL35、RH40、HS15 3种乳化剂对茶油增溶量较大,因此,分别以EL35、RH40、HS15为乳化剂进一步筛选最优乳化剂。

将乳化剂/COS(1∶1)组成的混合乳化剂与油相按一定比例混合,在75℃磁力搅拌下,滴加纯化水,直至透明澄清的微乳形成,记录临界成乳比例,然后继续滴加纯化水,至外观不再发生变化。按油、水、混合乳化剂临界点的质量百分比,在伪三元相图中绘制曲线,确定O/W型微乳区,并计算其面积。微乳区越大,意味着被大量稀释后微乳的乳滴形态和微乳稳定性基本保持不变。结果见图1。从微乳区面积可知,EL35＞HS15＞RH40,说明EL35对茶油的乳化能力最强,故选择其为表面活性剂。

A.EL35;B.RH40;C.HS15图1 不同乳化剂的伪三相图(Km=1∶1,75℃)A.EL35;B.RH40;C.HS15Fig.1 Pseudoternary phase diagrams of different emulsifiers(Km=1∶1,75℃)

2.1.3.2 不同Km值对微乳形成的影响 Km为乳化剂与COS的质量比。以茶油为油相,EL-35为乳化剂,1,2-丙三醇为COS,考察在不同Km值(1∶1,1∶2,2∶1)条件下所形成的微乳区域。精密称取混合乳化剂(S/ CoS)和油相按一定质量比混合,在75℃、1 700 r·min-1磁力搅拌条件下滴加纯化水,直至透明澄清的微乳形成,记录临界成乳比例,绘制伪三元相图,结果见图2。

E.Km=1∶1;F.Km=2∶1图2 不同Km的伪三元相图(75℃)E.Km=1∶1;F.Km=2∶1Fig.2 Pseudoternary phase diagrams of different Km(75℃)

结果:Km值为1∶2时不成微乳;当Km值为2∶1和1∶1所成微乳区面积相差不大,由于药物黄连提取物与虎杖提取物在助乳化剂1,2-丙二醇中有较大的溶解度,选择Km值为1∶1载药量更大,综合考虑选择Km值为1∶1。

2.2 处方粒度及稳定性考察 从茶油/EL-35/1,2-丙二醇/水体系的伪三相图中选取含茶油比例较大的4个点(油∶混合乳化剂分别为1∶15,1∶14,1∶13,1∶12)确定处方,对其粒径进行评价,结果见表3。

表3 4种处方粒度及稳定性考察结果Tab.3 Results of particle size distribution and stability in four kinds of prescription

由结果可知,油与混合乳化剂比例为1∶12时形成的微乳不稳定,比例为1∶13时,粒径较大,为确保含药微乳的形成及工艺的重复性,选择油与混合乳化剂比例为1∶14。

2.3 制备工艺对微乳的影响 微乳的制备工艺与温度,转速,搅拌时间密切相关,因此采用单因素实验法,考察温度、转速、搅拌时间对微乳制备工艺的影响。本实验以微乳的粒径为指标,采用单因素实验法,考察温度、转速、搅拌时间对微乳制备工艺的影响。结果见表4～表6。结果:75℃条件下,1 400 r·min-1搅拌20 min,可得到较理想的微乳。

2.3.1 温度考察 考察60,75,90℃3个温度, 1 700 r·min-1的磁力搅拌器中搅拌30 min。见表4。

2.3.2 转速考察 在75℃条件下,分别考察1 100, 1 400,1 700 r·min-1。见表5。

2.3.3 搅拌时间考察 在75℃、1 400 r·min-1条件下分别考察搅拌时间10,20,30 min,结果见表6。

表4 3种制备温度考察结果Tab.4 Results of three kinds of preparation temperature

表5 3种转速考察结果Tab.5 Results of rotation speed test

表6 3种制备时间考察结果Tab.6 Results of three kinds of preparation time

2.4 微乳的制备 取黄连提取物、虎杖提取物,分别加至1,2-丙二醇中,充分溶解后,微孔滤膜滤过,按比例混合,调节pH,即得含药丙二醇,按处方比例加入茶油、EL35、含药丙二醇、水,75℃条件下,1 400 r·min-1搅拌20 min,即得微乳(黄连提取物∶虎杖提取物∶茶油∶EL35∶1,2-丙二醇∶水的质量比为1∶1.4∶1∶7∶7∶21)。

2.5 微乳的理化性质评价 采用激光粒度仪测定连杖微乳粒径及其分布。结果微乳的平均粒径为30.9 nm,粒径分布均匀。采用离心法,将连杖微乳放入高速离心机中,转速12 000 r·min-1离心30 min,微乳澄清透明,未出现相分离、沉淀和浑浊等现象。连杖微乳于冰箱4℃、室温放置3个月,外观保持澄清透明,未见分层、絮凝和破乳。

2.6 微乳的含量测定

2.6.1 盐酸小檗碱的含量测定

2.6.1.1 色谱条件和系统适应性 色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(50∶50)(每100 mL中加入十二烷基硫酸钠0.4 g,再以磷酸调节pH为4.0);检测波长为345 nm;柱温为30℃;流速为0.6 mL·min-1。理论板数按小檗碱峰计应不低于5 000。在此色谱条件下,微乳中辅料对盐酸小檗碱的测定无干扰。色谱图见图3。

A.供试品;B.盐酸小檗碱对照品;C.阴性对照溶液;1.盐酸小檗碱图3 盐酸小檗碱含测专属性图谱A.sample;B.berberine hydrochloride reference;C.negative control solution;1.berberine hydrochlorideFig.3 HPLC chromatograms of berberine hydrochloride

2.6.1.2 供试品溶液的制备 精密量取连杖微乳5 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。阴性微乳溶液同法制备。

2.6.1.3 标准曲线的绘制 取盐酸小檗碱对照品5.0 mg,精密称定,置10 mL量瓶,加甲醇溶解,微孔滤膜滤过,即得。精密吸取对照品溶液2,4,8,12,16,20 μL注入液相色谱仪,记录色谱峰面积,按“2.6.1.1”项操作方法进样分析,以色谱峰面积(Y)对盐酸小檗碱质量(X,μg)进行线性回归,得回归方程为Y=5 584 062. 215 6X+809 040.779 9,r=0.999 3;表明盐酸小檗碱在0.925～9.253 μg范围内均呈良好线性关系。

2.6.1.4 精密度考察 吸取盐酸小檗碱对照品溶液适量,微孔滤膜滤过,取续滤液,按“2.6.1.1”项方法连续测定6次,记录色谱峰面积,计算精密度,结果平均峰面积为23 875 933,RSD为0.67%(n=6),说明仪器精密度良好。

2.6.1.5 稳定性考察 按照“2.6.1.1”项色谱条件,精密量取连杖微乳5 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜滤过,于0,2,4,8,12,24 h分别测定,记录峰面积,盐酸小檗碱含量测定结果RSD为0.44%,表明连杖微乳供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.6.1.6 重复性实验 分别精密量取连杖微乳5 mL6份,分别置10 mL量瓶,加甲醇稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜滤过,按照“2.6.1.1”项色谱条件测定。由实验结果可知,盐酸小檗碱含量RSD为1.99%,结果表明重复性良好。

2.6.1.7 加样回收率实验 取己知含量的连杖微乳6份各2.5 mL,置10 mL量瓶,分别加入盐酸小檗碱对照品溶液(2.25 mg·mL-1)2 mL,加甲醇稀释至刻度,按照“2.6.1.1”项色谱条件测定。结果盐酸小檗碱平均回收率为99.16%,RSD为2.47%。表明本方法回收率良好。

2.6.1.8 盐酸小檗碱含量测定 取3批同一处方的连杖微乳,按照“2.6.1.2”项供试品制备方法制备供试品溶液,按照“2.6.1.1”项色谱条件进行测定,结果连杖微乳中盐酸小檗碱含量分别为1.76,1.83, 1.81 mg·mL-1,平均1.80 mg·mL-1。

2.6.2 虎杖苷的含量测定

2.6.2.1 色谱条件和系统适应性 色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈-水(23∶77);检测波长为306 nm;柱温为30℃;流速为1.0 mL·min-1。理论板数按虎杖苷峰计应不低于3 000。在此色谱条件下,微乳中辅料对虎杖苷的测定无干扰。色谱图见图4。

A.供试品;B.虎杖苷对照品;C.阴性对照溶液;1.虎杖苷图4 虎杖苷含测专属性图谱A.sample;B.polydatin reference;C.negative control solution; 1.polydatinFig.4 HPLC chromatograms of Polydatin

2.6.2.2 供试品溶液的制备 精密量取连杖微乳1 mL,置10 mL量瓶,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。同法制备阴性微乳溶液。

2.6.2.3 标准曲线的绘制 取经五氧化二磷为干燥剂减压干燥24 h的虎杖苷对照品适量,精密称定,加稀乙醇稀释成浓度为30.32 μg·mL-1。精密吸取混合对照品溶液2,4,8,12,16,20,30 μL注入液相色谱仪,记录色谱峰面积。以色谱峰面积(Y)对盐酸小檗碱的质量(X,μg)进行线性回归,得回归方程为Y= 3 541 308.276 5X+6 336.880 2,r=0.999 9。表明虎杖苷在0.060 64～0.909 60 μg范围内与峰面积的线性关系良好。

2.6.2.4 精密度考察 按照“2.6.2.1”项色谱条件,吸取虎杖苷对照品溶液适量,微孔滤膜滤过,取续滤液,连续测定6次,记录色谱峰面积,计算精密度,结果平均峰面积为1 079 758,RSD为0.28%(n=6),说明仪器精密度良好。

2.6.2.5 稳定性考察 按照“2.6.2.1”项色谱条件,精密量取连杖微乳1 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜滤过,于0,2,4,8,12,24 h分别测定,记录峰面积,虎杖苷24 h内含量测定结果RSD为0.80%,表明连杖微乳供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.6.2.6 重复性考察 分别精密量取6份连杖微乳1 mL,置10 mL量瓶,加甲醇稀释至刻度,摇匀,微孔滤膜滤过,按照“2.6.2.1”项色谱条件测定。由实验结果可知,虎杖苷含量RSD为1.28%,表明重复性良好。

2.6.2.7 加样回收率考察 取己知含量的连杖微乳6份各0.5 mL,置10 mL量瓶,分别加入虎杖苷对照品溶液(0.45 mg·mL-1)2 mL,加甲醇稀释至刻度,摇匀,按照“2.6.2.1”项色谱条件测定。结果表明,虎杖苷平均回收率为98.27%,RSD为1.02%,结果表明本方法回收率良好。

2.6.2.8 虎杖苷含量测定 取同一处方的3批连杖微乳,按照“2.6.2.2”项供试品溶液制备方法制备供试品溶液,按照“2.6.2.1”项色谱条件进行测定,结果连杖微乳中虎杖苷含量分别为0.34,0.33,0.33 mg·mL-1,平均0.33 mg·mL-1。

3 讨论

在处方研究中,由于处方中已经含有茶油,为减少处方组分及乳化剂用量,单独以茶油作为微乳油相。

乳化剂与COS比例Km值筛选过程中,Km值为2∶1时的微乳区稍微比Km值为1∶1时的要大,但是考虑黄连、虎杖提取物主要溶解于COS1,2-丙二醇中,为提高微乳中药物有效成分的含量,选择乳化剂与COS比例为1∶1。

本制剂同时含有难溶性的黄连生物碱、虎杖蒽醌及二苯乙烯类和低极性茶油等有利于烧烫伤康复的成分,后续测定表明表小檗碱、黄连碱、巴马汀、盐酸小檗碱等含量显著高于常用油剂。

由于植物油微乳化较难,本制剂植物油比例较低。国外对植物油微乳适用乳化剂开展较多研究,开发了乳化增溶效果更佳的乳化剂,如文献[11-12]制备了含乳化剂用量为3%～4%的大豆油、瓜子油、橄榄油等植物油微乳,为该类制剂的研究提供了参考。

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DOI 10.3870/yydb.2014.07.024

Preparation of Lianzhang Microemulsion

LIN Li1,YIN Shan-shan1,LIU Pan1,ZHU Li2,CHEN Wei3,LIN Ji1,ZHANG Jun1
(1.NewDrug Research and Development Center,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China;2.Guangdong College of Pharmacy,Guangzhou 510006,China;3.Guangzhou Pharmaceutical Research Institute Co.Ltd., Guangzhou 510240,China)

ObjectiveTo preparelianzhangmicroemulsion and investigate its physicochemical properties.MethodsThe formulation was optimized with the pseudo-ternary phase diagrams drawn in a titration method.The process parameters were screened by a single factor test,and the physical and chemical properties of the microemulsion were preliminarily studied.ResultsThe formulation oflianzhangmicroemulsion was as follows:copts root extracts:polygonumcuspidatumextracts∶tea oil∶EL35∶propylene glycol∶water as 1∶1.4∶1∶7∶7∶21.The microemulsion was obtained with mean diameter of 30.9 nmby stirring the solution for 20 min at 1 400 r·min-1and 75℃.The particles were uniformly distributed,and the microemulsion was clear and transparent without turbidity,phase separation and precipitation after the temperature test and acceleration test.ConclusionThe preparation technology oflianzhangmicroemulsion is simple and stable.

Lianzhangmicroemulsion;Preparation technology;Quality evaluation

R286;TQ460.1

A

1004-0781(2014)07-0926-06

2013-10-07

2013-11-12

林丽(1988-),女,广东高州人,在读硕士,主要从事中药新药药学研究。E-mail:linli1220@yeah.net。

张军(1971-),男,研究员,硕士生导师,主要从事中药新药药学研究。E-mail:zhjxsh@aliyun.com。