十一方药酒回流提取制备工艺优选*

莫小林，伍小燕，龚敏阳，陈晓明，谭冬冬

(1.广西中医药大学第一附属医院药剂科，南宁 530023；2.广西医科大学2010级药学4班，南宁 530023)

十一方药酒回流提取制备工艺优选*

莫小林1，伍小燕1，龚敏阳1，陈晓明1，谭冬冬2

(1.广西中医药大学第一附属医院药剂科，南宁 530023；2.广西医科大学2010级药学4班，南宁 530023)

目的 优选十一方药酒回流提取制备工艺。方法以白酒浓度、白酒用量、提取时间为考察因素,以十一方药酒人参皂苷Rg1、大黄酚、山柰素的含量及总固体量为指标,采用正交实验法优选十一方药酒回流提取工艺。结果十一方药酒回流提取最佳工艺参数为6倍量50%白酒提取3 h。结论优选的制备工艺合理可行,可为十一方药酒的制备工艺选择提供参考。

十一方药酒；人参皂苷Rg1；大黄酚；山柰素；正交实验

十一方药酒为我院制剂室的制剂品种,由重楼、三七、红花、煅自然铜、乳香、秦艽、没药、续断、大黄、制马钱子等多味中药组成,全方具有活血散瘀、舒筋活络、消肿镇痛、祛风除湿等作用,临床用于跌打扭伤,各种骨折、骨伤,风湿骨痛等症,疗效显著。目前较常用的酒剂的制备方法为浸渍法、渗漉法、回流提取法或其他适宜方法［1］。我院十一方药酒的制备方法为浸渍法,该法存在生产周期长、溶剂挥发较多、药液损耗大等缺点。笔者采用正交实验法考察回流提取十一方药酒,为十一方药酒的制备工艺选择提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津DCU-20A5高效液相色谱仪；岛津SPD-20A紫外检测仪；GH-252电子分析天平(广州市艾安得仪器有限公司)；CD-UPT-II-10L超纯水制造系统(成都超纯科技有限公司)；KQ3200E 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 人参皂苷Rg1对照品(批号:110703-201027,含量96.3%),大黄酚对照品(批号:110796-201118,含量99.5%),山柰素对照品(批号110861-201209,含量95.9%)均购自中国食品药品检定研究院。十一方药酒(每瓶100 mL,批准文号:桂药制字Z01060025,批号:20120305,20120416,20120518)由广西中医药大学第一附属医院制剂室制备。乙腈(J.T. Baker,批号:12090072)、甲醇(J.T.Baker,批号: 12125062)、磷酸(天津市光复精细化工研究所,批号: 20110103)均为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 回流提取十一方药酒的正交实验设计 采用L9(33)正交表进行正交设计,对白酒浓度、白酒用量、提取时间进行考察,以人参皂苷Rg1含量、大黄酚含量、山柰素含量和总固体量为考察指标,进行回流提取,实验方案见表1。

2.2 样品溶液的制备 按处方量称取十一方药酒各药材,按L9(33)实验列号各条件分别回流提取,滤过,定容至1 000 mL,放置备用。

2.3 总固体量的测定 精密量取各样品溶液50 mL,置已干燥至恒重的蒸发皿中,水浴上蒸干,在105℃干燥3 h,移至干燥器中,冷却30 min,迅速精密称定质量,计算总固体量［2］。

表1 正交实验因素水平表Tab.1 Levels and factors of or thogonal design

2.4 人参皂苷Rg1的含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱:WondaSil C18Superb (4.6 mm×250 mm,5μm)；流动相:乙腈-0.05%磷酸溶液(22∶78)；检测波长205 nm；流速1.0 mL·min-1,进样量:20μL；柱温:30℃。在此条件下人参皂苷Rg1可与其他峰完全分离,保留时间约为20.8 min,理论板数不低于5 000。

2.4.2 溶液制备 ①对照品溶液制备:精密称取人参皂苷Rg1对照品2.1 mg置10 mL量瓶中,加甲醇制成每毫升含0.21 mg人参皂苷Rg1的对照品溶液；②供试品溶液的制备:精密吸取十一方药酒3.0 mL,水浴蒸干至无醇味,加水15 mL溶解,过滤,滤液用乙醚萃取2次,每次10 mL,弃去乙醚液,水溶液用水饱和的正丁醇萃取3次,每次8 mL,合并正丁醇液,超声处理30 min,用5%氢氧化钠溶液洗涤两次,每次10 mL,合并正丁醇液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解于25 mL量瓶中,摇匀,经孔径0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液。即得。

2.4.3 标准曲线绘制 精密吸取人参皂苷Rg1对照品溶液各0.1,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 m L,置10 m L量瓶中,用甲醇稀释至刻度,吸取上述溶液,各进样20μL,连续进样3次。以浓度为横坐标,峰面积积分值为纵坐标绘制工作曲线。回归方程为Y=3 237X+ 323.41,r=0.999 8,线性范围在2.1～42.0μg·mL-1,呈良好的线性关系。

2.4.4 精密度实验 精密吸取人参皂苷Rg1对照品溶液,连续进样6次,测定人参皂苷Rg1峰面积积分值,其RSD为1.15%,表明仪器精密度良好。

2.4.5 稳定性实验 取供试品溶液,分别于配制后0,1,2,4,8,12,24 h进样,供试品溶液24 h中峰面积值无明显变化,RSD为0.72%,表明供试品溶液中人参皂苷Rg1在24 h内稳定。

3)掘进机负压降尘装置可有效吸附掘进机掘进过程的灰尘，有效保障煤矿井下作业人员的身心健康和工作场所的作业安全。

2.4.6 重复性实验 取同一批十一方药酒(批号20120305)样品6份,分别按供试品溶液制备方法操作,进样20μL,测定峰面积积分值,计算人参皂苷Rg1的平均含量为0.258 mg·m L-1,RSD为0.90%。

2.4.7 加样回收实验 采用加样回收法,精密吸取已知含量的同一批号(20120416)样品6份,每份1.0 mL,分别加入浓度为0.583 mg·mL-1的人参皂苷Rg1对照品溶液0.4 mL,按供试品溶液的制备项下的方法提取并测定,计算回收率。结果平均回收率为96.7%,RSD为1.68%。

2.5 大黄酚的含量测定

2.5.1 色谱条件 色谱柱:WondaSil C18Superb (4.6 mm×250 mm,5μm)；流动相:甲醇-0.1%磷酸水溶液(84∶16)；检测波长254 nm；流速1.0 mL·min-1,进样量:20μL；柱温:30℃。保留时间约为13.7 min,理论板数不低于6 000。

2.5.2 溶液制备 ①对照品溶液制备:精密称取大黄酚对照品0.205 mg置10 mL量瓶中,加甲醇制成每毫升含20.5μg大黄酚的对照品溶液；②供试品溶液的制备:精密吸取十一方药酒3.0 mL,水浴蒸干至无醇味,加入10%盐酸溶液20 mL,超声处理30 min,用三氯甲烷溶液萃取3次,每次10 mL,合并三氯甲烷溶液,加2%碳酸钠溶液洗涤,弃去碳酸钠液层,三氯甲烷层用20 mL水洗涤,弃去水层,三氯甲烷层水浴挥干,甲醇定容于10 mL量瓶中,摇匀,经孔径0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液。即得。

2.5.3 标准曲线绘制 精密吸取大黄酚对照品溶液各0.1,0.3,0.8,1.4,2.0 m L,置5 mL量瓶,用甲醇稀释至刻度,吸取上述溶液,各进样20μL,连续进样3次。以浓度为横坐标,峰面积积分值为纵坐标绘制工作曲线。回归方程为Y=77 726X+7 175.1,r= 0.999 9,线性范围在0.41～8.20μg·mL-1呈良好的线性关系。

2.5.4 精密度实验 精密吸取大黄酚对照品溶液,重复进样6次,测定大黄酚峰面积积分值,其RSD为0.79%。

2.5.5 稳定性实验 取供试品溶液,分别在0,1,4, 8,12,24 h进样,每次20μL,供试品溶液24 h中峰面积值无大变化,RSD为1.06%,表明供试品溶液中的大黄酚在24 h内稳定。

2.5.6 重复性实验 取同一批样品(批号: 20120305),平行制备大黄酚供试品溶液6份,分别进样,每次20μL,测定峰面积积分值,计算大黄酚的平均含量为15.1μg·mL-1,RSD为1.53%。

2.5.7 加样回收实验 精密吸取已知含量的同一批号(20120416)样品6份,每份10.0 mL,分别加入0.163 mg·mL-1大黄酚对照品溶液为1.0 mL,按照“2.5.2”项供试品溶液的制备项下的方法提取并测定,计算回收率。结果平均回收率为97.6%,RSD为1.46%。

2.6 山柰素的含量测定

2.6.1 色谱条件 色谱柱:WondaSil C18Superb (4.6 mm×250 mm,5μm)；流动相:甲醇-0.4%磷酸水溶液(58∶42)；检测波长368 nm；流速1.0 m L·min-1,进样量:20μL；柱温:30℃。保留时间约为12.5 min,理论板数不低于4 000。

2.6.2 溶液制备 ①对照品溶液制备:精密称取山柰素对照品0.109 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇制成每毫升含1.09μg山柰素的对照品溶液；②供试品溶液的制备:精密吸取十一方药酒10 m L,水浴蒸干至无醇味,加30%盐酸3 mL和甲醇15 mL,加热回流30 min,放冷,移至25mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.6.3 标准曲线绘制 精密吸取山柰素对照品溶液各0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL,置5 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,吸取上述溶液,各进样20μL,连续进样3次。以浓度为横坐标,峰面积积分值为纵坐标绘制工作曲线。回归方程为Y=201 101X-387,r=0.999 7,线性范围在0.043 6～0.218 0μg·mL-1呈良好的线性关系。

2.6.4 精密度实验 精密吸取山柰素对照品溶液,重复进样6次,测定山柰素峰面积积分值,其RSD为0.98%。

2.6.5 稳定性实验 取供试品溶液,分别在0,4,8, 12,24 h进样,每次20μL,供试品溶液24 h中峰面积值无大变化,RSD为1.35%,表明供试品溶液中的山柰素在24 h内稳定。

2.6.6 重复性实验 取同一批样品(批号: 20120305),平行制备山柰素供试品溶液6份,分别进样,每次20μL,测定峰面积积分值,计算山柰素的平均含量为0.161μg·m L-1,RSD为1.69%。

2.6.7 加样回收实验 精密吸取已知含量的同一批号(20120416)样品6份,每份7.0 mL,分别加入浓度为1.09 mg·mL-1的山柰素对照品溶液1.0 mL,按“2.6.2”项供试品溶液的制备项下的方法提取并测定,计算回收率。结果平均回收率为98.4%,RSD为1.77%。

2.7 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL,注入液相色谱仪,分别测定并计算样品中人参皂苷Rg1、大黄酚和山柰素的含量。结果见表2。

2.8 结果 中药有效成分是中药复方发挥治疗作用的物质基础［3］,而总固体量影响制剂澄清度和成品稳定性。故选择人参皂苷Rg1、大黄酚和山柰素作为评价指标权重系数均为0.3,总固体量作为评价指标,权重系数为0.1。综上所述,以人参皂苷Rg1含量、大黄酚含量、山柰素含量及总固体量为指标,计算得出综合评分［4］并进行分析,结果及方差分析见表2,3。

根据各因素的极差值(R)显示,影响十一方药酒热回流提取效果的因素顺序为B>A>C,即溶剂用量>溶剂浓度>提取时间。其中因素B对实验结果有显著性影响,因素A与C对实验结果影响较小；结合实验结果、溶剂回收、节约时间等因素,最终确定回流提取最优工艺条件为A2B2C1,即6倍量50%的白酒回流提取3 h。

表2 正交实验设计及结果Tab.2 Or thogonal design and results

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.9 验证实验 按回流提取最佳工艺条件提取,制备3批样品进行验证实验,测定总固体量、人参皂苷Rg1、大黄酚和山柰素的含量。使用最佳验证工艺参数,总固体量达2.109 1 g,人参皂苷Rg1含量平均为0.264 mg·mL-1,大黄酚含量平均为16.0μg·mL-1,山柰素含量平均为0.160μg·mL-1,接近正交实验结果的最高值,说明正交实验结果可靠。

3 讨论

本实验以该方中三七的主要活性成分人参皂苷Rg1的含量和大黄中大黄酚的含量及红花中山柰素的含量为主要考察指标,通过正交实验对十一方药酒回流提取工艺进行优选,同时结合总固体量综合优选出最佳提取工艺条件为:6倍量50%白酒提取3 h。

测定人参皂苷Rg1时分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液等不同比例的流动相进行了考察,发现乙腈-0.5%磷酸溶液(22∶78)做流动相时人参皂苷Rg1分离效果最好。测定山柰素时考察了流动相的比例和检测波长的选择,结果选择甲醇-0.4%磷酸溶液(58∶42)作为流动相和波长为370 nm时,山柰素的分离度最高,峰形较对称。由于水解所用的酸的浓度对结果影响很大［5］,因此还考察了不同浓度的盐酸和加酸量的影响,结果表明加入30%盐酸3 mL水解完全。

［1］战渤玉,车绪凤,尉炳超.中药酒剂的研究进展[J].中医药信息,2010,27(3):120-122.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:附录10.

［3］杜冠华.中药复方有效成分组学研究[J].中成药,2002, 24(11):878-880.

［4］孙学惠,史国兵,何静,等.复方参芪五味咀嚼片制备中五味子与人参的醇提工艺[J].医药导报,2011,30(5):637-639.

［5］朱照静,邓开英.舒可心胶囊中总黄酮醇苷的含量测定[J].中国中药杂志,2003,28(6):569-570.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.026

Optimization of Reflux Extraction Process for Shiyifang Vinum

MO Xiao-lin1,WU Xiao-yan1,GONG Min-yang1,CHEN Xiao-ming1,TAN Dong-dong2
(1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital ofGuangχi Traditional Chinese Medicine Univeisity,Nanning 530023, China;2.Guangχi Medical University School of Pharmacy,Grade 2010,Class4,Nanning 530023,China)

Objective To optimize the reflux extraction process ofshiyifangvinum.MethodsThe preparation technology ofshiyifangvinum was optimized by adopting orthogonal test on concentration,wine quantity,reflux time as investigation factors and taking ginsenoside Rg1,contentof chrysophanol,kaempferoland totalextraction as references.ResultsThe optimum process of reflux extraction forshiyifangvinum was extracting for 3 hours with six times of wine(50%).ConclusionThe optimized process is reasonable and feasible,which is the good evidence for preparation ofshiyifangvinum.

Shiyifangvinum;Ginsenoside Rg1;Chrysophanol;Kaempferol;Orthogonal test

R286;R283

A

1004-0781(2014)01-0090-04

2013-01-30

2013-04-08

*广西中医药大学自然科学研究项目(P2010028)

莫小林(1974-),女,壮族,广西南宁人,副主任药师,学士,研究方向:制剂开发和质量标准研究。电话：0771-5645433,E-mail：moxiaolin@163.com。

伍小燕(1962-),女,广西全州人,主任药师,学士,研究方向:从事中药鉴定和质量标准研究。电话：0771-5642936,E-mail：yxbwxy@163.com。