香桂化浊胶囊的HPLC-PDA指纹图谱研究*

张辰辰，杨继章，吴丹，刘红淼

(河北医科大学第一医院药剂科，石家庄 050031)

香桂化浊胶囊的HPLC-PDA指纹图谱研究*

张辰辰，杨继章，吴丹，刘红淼

(河北医科大学第一医院药剂科，石家庄 050031)

目的 建立香桂化浊胶囊高效液相色谱-光电二极管阵列检测器(HPLC-PDA)指纹图谱的分析方法,完善香桂化浊胶囊的质量控制标准。方法以高效液相色谱法为基础,采用DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液,梯度洗脱,流速1.0mL·min-1,柱温30℃,检测波长280 nm。结果相同色谱条件下,8批香桂化浊胶囊的相似度均>0.9,药物组成一致性较好。结论该方法操作简便、准确,可作为香桂化浊胶囊的鉴别和质量控制。

香桂化浊胶囊；指纹图谱；桂皮醛；广藿香酮；大黄素

香桂化浊胶囊处方为河北医科大学第一医院临床应用多年的经验方,由肉桂、土大黄、广藿香组成。具有芳香醒脾、清化湿浊之功,其疗效确切。主治因各种疾病后邪留未尽、脾胃内伤所致长期大便溏泄或有黏液、腹胀肠鸣、纳呆或有低热、舌苔白腻或白滑或见微黄、脉濡缓；主要用于慢性肠炎、真菌感染致肠炎证属脾虚湿困的治疗。关于本方制剂工艺、质量控制、含量测定及毒理学研究的方法已有报道［1-6］。鉴于香桂化浊胶囊在化学组成上是一个复杂体系,各成分构成不明确,有效成分和杂质没有明确的划分,化学成分间共存的相互作用不明确,而中药指纹图谱能够部分反映中药中所含化学成分的组成、数量及其适当的比例关系［7］。为更好地控制香桂化浊胶囊的质量,完善其检测标准,笔者采用高效液相色谱(HPLC)法,建立了香桂化浊胶囊的指纹图谱。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20A高效液相色谱仪,包括四元梯度泵、在线脱气机、光电二极管阵列(photo-diode-array, PDA)检测器、数据处理工作站(日本岛津公司)；BS210S型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)；KQ2200E型超声波清洗仪(频率:40 kHz,功率: 100W,昆山市超声仪器有限公司)；《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》(国家药典委员会)。

1.2 试药 甲醇、乙腈(色谱纯,美国TEDIA公司),水为娃哈哈纯净水,其他试剂均为分析纯。大黄素对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110756-200110)；广藿香酮对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111822-201001)；桂皮醛对照品(四川省维克奇生物科技有限公司,批号:101114,纯度:HPLC≥98%)；香桂化浊胶囊(河北医科大学第一医院制剂室,批号:120208,120222,120229,120314,120328, 120404,120411,120425)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取肉桂醛、广藿香酮、大黄素对照品适量,分别置10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀。分别取肉桂醛、广藿香酮和大黄素对照品各1 mL至10 m L量瓶中,用甲醇稀释定容成浓度分别为200.00,15.87,85.16μg·m L-1的混合溶液,即得。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取香桂化浊胶囊0.74 g,置50 mL量瓶中,加甲醇至刻度,精密称重,浸泡2 h后超声处理30 min,冷却后用甲醇补足失重,摇匀,经孔径0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.3 色谱条件和系统适用性实验 色谱柱: DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm,5μm)；流动相:甲醇-乙腈-0.1%醋酸溶液,梯度洗脱,以甲醇为流动相A,乙腈为流动相B,0.1%醋酸溶液为流动相C,洗脱程序见表1；检测波长:280 nm；柱温:30℃；进样量: 20μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

2.4 参照物肉桂醛的确定 将上述已配制好的肉桂醛、广藿香酮和大黄素对照品混合溶液和供试品溶液按“2.3”项下的分离条件进行测定,得图1。根据单一对照品保留时间及相应对照品紫外光谱得知图1中1号峰为肉桂醛峰,2号峰为广藿香酮峰,3号峰为大黄素峰。肉桂醛峰与相邻峰分离度良好,保留时间适中,故选作参照峰(S),确定18个共有峰。计算各样品中非共有峰占总峰面积的比值,结果表明其值均<5%。90 min样品供试品溶液色谱图表明,组分在65 min内出峰完全。

2.5 方法学考察

2.5.1 稳定性实验 精密量取批号为120208的香桂化浊胶囊供试品溶液,按上述色谱条件分别在0,2,4, 8,12,24,48 h进样测定,记录各共有峰保留时间和面积,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积,结果表明各共有峰的相对保留时间的RSD=0.28%～0.97%,相对峰面积的RSD 0.76%～2.33%,表明供试品溶液在48 h内稳定。

图1 两种溶液的HPLC色谱图A.对照品;B.供试品;1.肉桂醛;2.广藿香酮;3.大黄素Fig.1 HPLC chromatogram of two kinds of solutionsA.reference;B.test;1.cinanamic aldehyde reference; 2.patchouli ketone reference;3.emodin reference

2.5.2 精密度实验 精密称取批号为120208的香桂化浊胶囊供试品溶液适量,按上述色谱条件连续进样5次,记录各共有峰保留时间和面积,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积,结果表明各共有峰的相对保留时间的RSD 0.16%～0.84%,相对峰面积的RSD 0.48%～2.01%,表明本实验所用仪器的精密度良好。

2.5.3 重复性实验 精密称取批号为120208的香桂化浊胶囊适量,制备供试品溶液5份,按上述色谱条件分别进样测定,记录各共有峰保留时间和面积,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积,结果表明,各共有峰的相对保留时间的RSD 0.39%～0.47%,相对峰面积的RSD 0.89%～2.58%,表明本实验重复性良好。

2.6 指纹图谱的建立及分析

2.6.1 指纹图谱的建立 取8批香桂化浊胶囊,按“2.2”项下的方法制备供试品溶液,按“2.3”项下的色谱条件进样检测进行测定,得到8批样品的指纹图谱。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”得到其叠加图,见图2。

2.6.2 共有指纹峰的标定及计算 根据8批供试品溶液的测定结果,分析确定了香桂化浊胶囊的18个共有指纹峰,以肉桂醛为参考峰,将其相对保留时间和相对峰面积定为1,计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD,得到各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均<2%,结果见表2,3。

图2 8批样品和对照品的HPLC指纹图谱S1～8.第1～8批样品;R.对照品;1.肉桂醛;2.广藿香酮; 3.大黄素Fig.2 HPLC fingerprints of 8 batches of samples and referenceS1-8.first to eighth batches of samp les;R.reference; 1.cinanam ic aldehyde;2.patchouli ketone;3.emodin

2.6.3 香桂化浊胶囊指纹图谱相似度测定 采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》评价8批香桂化浊胶囊的指纹图谱,以均值法生成对照指纹图谱,建立共有模式,测得各批次样品与共有模式间的相似度,结果均在0.9以上,说明工艺较稳定,结果见表4。

3 讨论

笔者主要是建立香桂化浊胶囊的HPLC-PDA指纹图谱特征,并对不同批次的香桂化浊胶囊进行比较,为有效控制香桂化浊胶囊的质量提供了新方法。为了得到满意的分离效果,实验比较了水、甲醇、乙醇(分别为25%,50%,75%,100%)对提取率(超声和回流)的影响。结果显示,纯甲醇的提取率最高,超声效果优于回流,所以确定提取方法为纯甲醇超声提取。对于流动相的选择,笔者尝试了甲醇-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液以及甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液。结果发现,甲醇-0.1%冰醋酸溶液的色谱峰分离度小,不符合高效液相色谱法的要求；乙腈-0.1%冰醋酸溶液和甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液作为流动相的分离结果相似。故选择甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液作为流动相。关于检测波长的选择,本实验比较了香桂化浊胶囊在254,280和310 nm波长下的图谱。结果显示,在280 nm的波长下,色谱基线平稳,噪声干扰最小,各色谱峰吸收度适中,出峰均匀,图谱信息完整,因此选择280 nm作为检测波长。

通过相似度计算,发现8批样品具有相同的色谱特征峰,且各峰的保留时间稳定,相似度较高,表明该实验所建立的方法稳定性好,具有可操作性。本方法操作简便、准确,可作为香桂化浊胶囊的鉴别和质量控制。

表2 8批香桂化浊胶囊指纹图谱共有峰的相对保留时间Tab.2 Relative retention time of the common peaks of HPLC fingerprints of 8 batches of xianggui huazhuo capsule min

表3 8批香桂化浊胶囊指纹图谱共有峰的相对峰面积Tab.3 Relative peak area of the common peaks of HPLC fingerprints of 8 batches of xiangguihuazhuo capsule

表4 8批香桂化浊胶囊指纹图谱相似度数据Tab.4 Sim ilarity of HPLC fingerp rints of 8 batches of xianggui huazhuo capsule

［1］刘红淼,姜少灏,张振杰,等.正交实验优选香桂化浊胶囊中挥发油的包合工艺[J].中国药房,2010,21(47):4449-4450.

［2］刘红淼,房桂珍,李艳玲,等.香桂化浊胶囊成型工艺研究[J].中国药房,2011,22(11):990-991.

［3］刘红淼,杨继章,王云志,等.香桂化浊胶囊质量标准研究[J].中国药房,2011,22(27):2553-2554.

［4］杨继章,刘红淼,李艳玲.肉桂油的研究进展[J].中国药房,2011,22(27):2579-2581.

［5］刘红淼,杨继章,李艳玲.HPLC法测定香桂化浊胶囊中大黄素的含量[J].中国药房,2012,23(15):1397-1398.

［6］刘红淼,李艳玲,杨继章,等.香桂化浊胶囊毒理学研究[J].医药导报,2013,32(2):17-21.

［7］李家春,孙兰,李红娟,等.桂枝茯苓胶囊HPLC指纹图谱研究[J].中草药,2012,43(7):1333-1335.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.025

Study on HPLC-PDA Fingerprints of Xianggui Huazhuo Capsule

ZHANG Chen-chen,YANG Ji-zhang,WU Dan,LIU Hong-miao
(Department of Pharmacy,the First Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050031,China)

Objective To establish a HPLC-PDA fingerprint analysis for theχianggui huazhuocapsule,and improve the quality control standard for it. ，MethodsHPLC separation was carried out on DiamonsilTMC18column(250 mm× 4.6mm,5μm).Themobile phase was composed ofmethanol,acetonitrile and 0.1%glacial acetic acid with gradient elution. The flow rate wasmaintained at 1.0 mL·min-1and the column temperature was set at 30℃.The detective wavelength was 280 nm.ResultsUnder the same chromatographic conditions,the similarity of eight batches ofχianggui huazhuocapsule was above0.9,and the chemical composition was consistent among different batches.ConclusionThe operation is simple and accurate,and therefore can be used for the identification and quality control ofχianggui huazhuocapsule.

Xianggui huazhuocapsule;Fingerprint;Cinanamic aldehyde;Patchouli ketone;Emodin

R284;R927.2

A

1004-0781(2014)01-0086-04

2013-01-09

2013-05-22

*河北省中医药管理局科研计划课题资助项目(2012083)

张辰辰(1987-),女,河北石家庄人,在读硕士,研究方向:药剂学。电话：(0)15333315270,E-mail：zhangchenchen6666@163.com。

杨继章(1957-),男,河北邢台人,主任药师,教授,硕士生导师,研究方向:药物新剂型、药物稳定性。电话： 0311-85917352,E-mail：yjzh1957@163.com。