艾迪注射液对小鼠放射性肺损伤的防治作用

黎建绪，郑雅梅，胡晓燕，滕凯，曹如波，刘莉

(华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心，武汉 430023)

艾迪注射液对小鼠放射性肺损伤的防治作用

黎建绪，郑雅梅，胡晓燕，滕凯，曹如波，刘莉

(华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心，武汉 430023)

目的观察艾迪注射液在放射性肺损伤中的防治作用,并探讨其相关机制。方法将SPF级C57BL/6小鼠120只随机分为4组:空白对照组,照射+艾迪组,照射+甲泼尼龙组和照射组,每组30只。给予小鼠单次12 Gy胸部照射以建立放射性肺损伤模型,照射前2 h及以后每日腹腔注射艾迪及甲泼尼龙。分别于照射后1,24,72 h及1,2,4,8, 16和24周处死小鼠,取左肺固定做组织切片,行苏木精-伊红(HE)染色观察病理变化、Masson染色观察胶原形成和免疫组化检测转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白含量,取右肺行Western-blot测定TGF-β1蛋白含量,Real-time聚合酶链反应(PCR)测定TGF-β1mRNA含量。结果小鼠在接受照射后于1～2周出现放射性肺炎表现,TGF-β1mRNA和蛋白含量升高,但在给予艾迪注射液和甲泼尼龙处理组中TGF-β1mRNA和蛋白相对含量较照射组少,差异有统计学意义(P<0.05),照射+艾迪组和照射+甲泼尼龙组差异无统计学意义。在照射后16及24周观察到纤维形成增加,但照射+艾迪组和照射+甲泼尼龙组较照射组少。结论艾迪注射液和甲泼尼龙可以下调因照射引起的TGF-β1mRNA和蛋白含量上升,二者在此作用上未观察到差别,这可能是其减轻放射性肺损伤的关键。

艾迪注射液；损伤,肺,放射性；转化生长因子β1

放射治疗(放疗)是胸部恶性肿瘤治疗的主要方法之一,但由于在放疗过程中部分肺组织不可避免地受到照射,且肺是放射敏感器官,因此由放疗引起放射性肺损伤成为胸部肿瘤治疗的一个常见并发症,这不但影响放疗剂量进而影响肿瘤治疗效果,还降低患者生活质量甚至危及生命。放射性肺损伤分为放射性肺炎(放疗后1～3个月)和放射性肺纤维化(放疗后数月至数年)。国内外许多研究证明抑制转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的生成可以缓解放射性肺损伤症状并改善的程度。临床上放射性肺炎的治疗药物仍然主要是大剂量糖皮质激素,但其易致肿瘤复发,不良反应多,而放射性肺纤维化至今仍无特效药物［1-2］。近年来,中药在防治放射性肺损伤中的作用越来越受到关注。临床研究表明一些具有清热解毒、养阴益气、活血化瘀功效的中药具有不同程度的预防和治疗放射性肺损伤的作用［3］。笔者观察了艾迪注射液对小鼠放射性肺损伤的预防和治疗作用,对其可能的作用机制进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级8周龄C57BL/6雌鼠120只,体质量(20±2)g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,饲养于SPF级小鼠饲养室。

1.2 试药 艾迪注射液(贵州益佰制药股份有限公司,批号:20111020),其组方为斑蝥、人参、黄芪、刺五加。艾迪注射液10 mL加0.9%氯化钠溶液稀释20 mL配成工作液,腹腔注射0.15 mL·(10 g)-1(生药3.75 g·kg-1)；甲泼尼龙［甲泼尼龙琥珀酸钠,法玛西亚普强(中国)有限公司产品,批号:20111123］,甲泼尼龙40 mg加0.9%氯化钠溶液至64.5 mL配成工作液,腹腔注射0.15 mL·(10 g)-1(9.3 mg·kg-1)。兔抗小鼠TGF-β1一抗(BioVision,CA 94043 USA),山羊抗兔二抗(Proteintech Group),ReverTra Ace-α-(Code No:FSK-100,toyobo),SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa,Code:DRR420A),

1.3 仪器 免疫组化试剂盒(中杉金桥,SP9001), TRIzol Reagent(Invitrogen,15596026),ABI StepOnePlusTM,六一电泳仪(北京,DYCZ-24DN), OLYMPUS TH4-200。

1.4 动物分组与造模 小鼠随机分为4组(空白对照组,照射+艾迪组,照射+甲泼尼龙组和照射组),照射前小鼠腹腔注射10%水合氯醛0.06 mL麻醉,麻醉后采用自治固定装置固定,仰卧于治疗床。SSD＝100 cm,射野40 cm×3 cm,d＝3 cm,双肺中平面单次照射12 Gy,建立小鼠放射性肺损伤模型［4］。照射前2 h和照射后每日同一时间予艾迪注射液或甲泼尼龙腹腔注射,于照射后1,24,72 h及1,2,4,8,16和24周各组分别随机取3只小鼠处死,左肺用4%多聚甲醛固定2 d后包埋,右肺分3块后置-80℃保存以提蛋白做Western-blot或提RNA做逆转录及实时逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcripiase polymerase chain reaction,Real-time RT-PCR)。

1.5 组织病理检查 常规苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色,光镜下观察病理组织结构。16和24周小鼠行Masson染色观测胶原含量。

1.6 免疫组化 用包埋的组织做切片,在二甲苯中脱蜡和梯度乙醇溶液中再水化,放在枸橼酸盐中96℃1 h抗原修复,封闭15 min后加入兔抗小鼠TGF-β1一抗(稀释比1∶20),4℃过夜,用过氧化氢(H2O2) 37℃20 min灭活内源性过氧化物酶,加入二抗37℃ 30 min后加辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃30 min,在显微镜下控制二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)染色时间后苏木精6 s染核,脱水并封片。免疫组化半定量评分法［5］,0分:无着色,与背景色一致,阳性细胞比例<5%,阴性(细胞内出现黄色颗粒为阳性)；1分:浅黄色,略高于背景色,阳性细胞率<10%；2分:棕黄色,明显高于背景色,阳性细胞率为～50%；3分:棕褐色,阳性细胞率为～75%；4分:阳性细胞率为>75%。

1.7 Real-time RT-PCR 主要步骤:在研磨器中加入TRIzol并研磨组织后提总RNA,后按ToYoBo FSK-100说明进行逆转录,按SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)说明加试剂后行两步法PCR反应,反应条件如下:预变性95℃30 s,扩增条件95℃5 s,60℃35 s,重复40个循环。引物序列如下:β-actin上游引物GCATTGCT-GACAGGATGCAG下游引物CCTGCTTGCTGATCCACATC,TGF-β1上游引物TGCGCTTGCAGAGATTAAAA,下游引物AGCCCTGTATTCCGTCTCCT。引物序列经Premier 5.0和Oligo7设计验证。

1.8 Western-blot 在研磨器中加入RIPA蛋白裂解液研磨溶解组织后提取总蛋白,加样后在浓缩胶和分离胶中电泳分离蛋白,在转膜液中用0.45μm聚偏氟乙烯树脂［poly(vinylidene fluoride),PVDF］膜150 mA转膜100 min,5%牛奶封闭1 h后覆一抗4℃过夜,覆二抗1 h后行电致化学发光(electrochemiluminescence,ECL)显色反应。结果用Gel-Pro analyzer软件读出内参、目的积分灰度值(IA),相对含量即为目的积分灰度值/内参积分灰度值。

1.9 统计学方法 所有数据均使用SPSS18.0版软件进行分析,运用单向方差分析(ANOVA)方法进行统计,当P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织病理学改变 HE染色在空白对照组未观察到肺泡炎改变,无明显炎性细胞浸润,肺泡间隔未见增厚；而所有接受照射的小鼠从72 h到1周起出现肺泡壁水肿、充血,并有大量炎症细胞浸润,肺泡间隔增厚,照射+艾迪组和照射+甲泼尼龙组一般为0～1级肺泡炎表现,而照射组则一般表现为2～3级肺泡炎。Masson染色在空白对照组未观察到明星胶原沉积,所有接受照射小鼠的胶原明显增多,但照射+艾迪组和照射+甲泼尼龙组明显较照射组少,而这两组之间无明显差别。见图1,2。

2.2 免疫组化 空白对照组支气管上皮呈不均一表达,肺实质少量肺泡巨噬细胞呈阳性表达,而血管内皮和肌层均呈阴性。所有接受照射的小鼠在照射后72 h和2,4,8,16和24周均可见大量肺泡巨噬细胞和Ⅱ型肺泡细胞呈阳性表达,还可见许多阳性纤维母细胞增生,以16周明显。以免疫组化半定量评分法计算,照射后1,2,4,8,16和24周所有照射的小鼠TGF-β1含量明显升高,在8和16周达到高峰,除1周外,照射组TGF-β1含量较照射+艾迪组和照射+甲泼尼龙组高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),同时在72 h,照射组也较照射+艾迪组和照射+甲泼尼龙组高,差异有统计学意义。照射+艾迪组和照射+甲泼尼龙组TGF-β1含量在任一时间点均差异无统计学意义。见图3,4。

2.3 Real-time RT-PCR 照射后1,2,4,8和16周时照射+艾迪组和照射+甲泼尼龙组肺组织TGF-β1mRNA的表达较照射组低,差异有统计学意义,照射+艾迪组和照射+甲泼尼龙组肺组织TGF-β1mRNA的表达在任一时间均差异无统计学意义,但仍高于空白对照组,所有受到照射小鼠的TGF-β1mRNA表达在照射后8周达到最高峰。见图5。

图1 4组小鼠1周时肺组织HE染色(×400)A.空白对照组;B.照射+艾迪组;C.照射+甲泼尼龙组;D.照射组Fig.1 HE staining on lung tissues of four groups ofmice after one weekA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group;C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

图2 4组小鼠24周时Masson染色(×400)A.空白对照组;B.照射+艾迪组;C.照射+甲泼尼龙组;D.照射组Fig.2 Masson staining on four groups of mice after 24 weeksA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group;C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

图3 4组小鼠8周时免疫组化图A.空白对照组;B.照射+艾迪组;C.照射+甲泼尼龙组;D.照射组Fig.3 Immunohistochemical staining on four groups ofmice after eight weeksA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group;C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

图4 4组小鼠免疫组化半定量评分法计算得到的TGF-β1表达量

图5 4组TGF-β1mRNA含量

2.4 Western-blot 照射组在照射后8和16周检测到TGF-β1蛋白相对含量(目的IA/内参IA)较照射+艾迪组和照射+甲泼尼龙组高,差异有统计学意义。所有受到照射小鼠的TGF-β1蛋白相对含量均较空白对照组增高,差异有统计学意义,然而也观察到照射+艾迪组在16周TGF-β1蛋白相对含量较照射+甲泼尼龙组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

图6 4组在8和16周用W estern blot检测到TGF-β1表达量A.空白对照组;B.艾迪+照射组;C.甲泼尼龙+照射组;D.照射组Fig.6 TGF-β1protein expression in four groups of mice after 8 weeks and 16 weeksA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group; C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

3 讨论

放射性肺炎是由免疫介导的产生双侧淋巴细胞性肺泡炎和局部放射反应,其病理学基础是射线直接作用于DNA,导致基因和大分子化合物的损伤以及脂质过氧化作用的间接启动凋亡途径和炎症的级联效应［6-7］。放射性肺纤维化则是在急性放射性肺炎发生的迁延,由损伤的靶细胞(主要是肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞等肺内效应细胞)释放多种细胞因子,尤其是促纤维细胞生长因子,如TGF-β1、PDGF、FGF等,启动成纤维细胞的增殖分裂,促进胶原蛋白的大量合成,最终形成胶原沉积［8-9］。许多研究表明肺部受照射后,多种细胞因子合成增加,特别是白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、TGF-β1和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factorα,TNF-α)［10］。进一步研究显示, TGF-β1是诱发放射性肺纤维化的关键因素,具有强促纤化作用,它主要作用于胶原的转录和翻译过程,加速肺纤维化的发生,并能趋化炎性细胞及单核巨噬细胞,诱导其合成释放PDGF、TNF、IL-1、IL-6等细胞因子,扩大生物效应［11］。综上所述,细胞因子尤其是TGF-β1的致炎及纤维化作用及其产生的级联放大效应是导致放射性肺损伤和纤维化的重要机制。研究也表明,通过有效的干预策略,放射性肺损伤的病程或病理学改变可被有效逆转,而阻断TGF-β1的信号转导通路或降低TGF-β1的表达无疑是应高度关注的靶点［12］。

目前临床上主要治疗放射性肺炎的药物仍是大剂量糖皮质激素,但由于糖皮质激素长期使用易致肿瘤复发、多种不良反应产生,而放射性肺纤维化至今仍无特效药物。故亟需寻找能防治放射性肺损伤且不良反应少的药物。多数中药以不良反应轻著称,可能在防治放射性肺损伤上有一定优势传统医学大多数学者认为放射线是一种热毒燥邪,放射性肺纤维化乃因热毒内侵、灼伤肺络、伤津耗气,进而导致血络瘀阻。治疗上主要有清热解毒、益气养阴和活血化瘀3种方法［13-15］。本实验组成员也重点研究中药在放射性肺损伤中的作用,研究表明参芪扶正液具有下调TGF-β1和TNF-α的作用从而发挥防治放射性肺损伤作用［16-17］。艾迪注射液中的黄芪、人参具有不同程度的抗氧化和清除自由基的作用,从而减少射线造成的过氧化损伤,减轻放射性肺损伤；斑蝥有攻毒蚀疮,破血散结的作用能改善血液循环作用,而起到抑制胶原纤维合成及抗纤维化作用,此外其还可通过影响与放射性肺炎有关细胞因子的表达而发挥作用［18］。

在本实验结果中,艾迪注射液与甲泼尼龙显示出减轻放射性肺损伤的作用。照射组小鼠的肺HE染色显示放射性肺炎程度较空白对照组、照射+艾迪组和照射+甲泼尼龙组明显严重；照射组小鼠胶原形成较其他3组明显增多；在多个时间点时照射组小鼠TGF-β1蛋白及mRNA水平较其他3组增多。在16周Westernblot测定提示可能艾迪在防治放射性纤维化较甲泼尼龙的作用更强。艾迪注射液防治放射性肺损伤的作用机制可能为通过影响细胞因子表达,从而抑制关键因子TGF-β1的转录和翻译,使其表达量减少。其相关机制尚需进一步研究。

总之,本研究表明艾迪注射液可以在一定程度上防治小鼠放射性肺损伤,其作用与甲泼尼龙相似。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.013

Preventive and Therapeutic Effect of Aidi Injection on Radiation-Induced Lung Injury

LI Jian-xu,ZHENG Ya-mei,HU Xiao-yan,TENG Kai,CAO Ru-bo,LIU Li
(Cancer Center,Union Hospital, Tongji Medical College,Huazhong University ofScience and Technology,Wuhan 430023,China)

Objective To study the effect ofaidiinjection on radiation-induced lung injury and the probable Mechanism.MethodsOne hundred and twenty C57BL/6 mice were exposed to either shamradiation or single fraction of 12 Gy delivered to the thorax.Four groupswere defined as follows:in normal controlgroup,themice received neither radiation nor drug;inaidiinjection+radiation group,the mice received radiation andaidiinjection;in Solu Medrol+radiation group,the mice received Solu Medrol;in radiation group,themice were exposed to radiation.Aidi or Solu Medrolwere injected intraperitoneally 2 h before the radiation and daily after the radiation.Mice were sacrificed 1,24,72 hours,1,2,4,8,16 and 24 weeks after radiation.The left lungs were fixed and sectioned.The sections were stained by haematoxylin and eosin,masson stain and immunohistochemical stain for transforming growth factorβ1(TGF-β1).The right lungs were collected to detect TGF-β1mRNA expression by real-time quantitative reverse transcipiase polymerase chain reaction(RT-PCR)and TGF-β1protein expression by Western blotting.ResultsPneumonitis developed 1 to 2 weeks after radiation.Their TGF-β1mRNA and protein expression levels in radiation-treated mice were significantly higher than those in normal control group(bothP<0.05).But the effectswere reversed byaidiand Solu Medrol treatment(P<0.05).The TGF-β1mRNA and protein expression levels were not significantly different betweenaidiand Solu Medrol treatment.ConclusionBothaidiinjection and Solu Medrol can significantly downregulate TGF-β1mRNA and protein expression levels in the lungs of mice with radiation-induced lung injury.There is no significant difference in the effect betweenaidiinjection and Solu Medrol.

Aidiinjection;Injury,radiation,lung;Transforming growth factor-1

R286;R965

A

1004-0781(2014)02-0184-05

2013-01-14

2013-04-03

黎建绪(1986-),男,广西梧州人,硕士,研究方向:恶性肿瘤早期诊断。电话:(0)15871492176,E-mail：lijianxu1236@163.com。

刘莉,女,教授,主任医师,博士生导师,博士,从事肿瘤诊治工作。电话:(0)13720378323,E-mail：liulixiehe2004@163.com。