镇肝熄风汤预处理对大脑中动脉梗死大鼠脑组织ET-1和AQP4及AQP9表达的影响*

吴艳霞，李秀娟，马威

(武汉市第一医院 1．老年病科；2．中心实验室，武汉 430022)

镇肝熄风汤预处理对大脑中动脉梗死大鼠脑组织ET-1和AQP4及AQP9表达的影响*

吴艳霞1，李秀娟1，马威2

(武汉市第一医院 1．老年病科；2．中心实验室，武汉 430022)

目的通过检测大脑中动脉梗死(MCAO)大鼠脑组织的内皮素(ET)-1、水通道蛋白4(AQP4)及水通道蛋白9(AQP9)含量的变化来研究镇肝熄风汤发挥神经保护作用的可能生物学基础。方法MCAO术前给予大、小剂量镇肝熄风汤(3.0,1.5 g·mL-1)灌胃14 d,采用线栓法制备MCAO。评价镇肝熄风汤预处理对MCAO大鼠脑缺血后行为障碍及脑水肿程度的影响;应用免疫组化方法研究镇肝熄风汤预处理对MCAO大鼠脑组织ET-1的影响;采用western blot技术分析MCAO大鼠缺血侧脑组织AQP4与AQP9表达量的变化和镇肝熄风汤预处理对其的影响。结果预先使用镇肝熄风汤14 d,可明显改善MCAO大鼠行为学障碍,减轻脑水肿程度;MCAO大鼠缺血侧脑组织中ET-1蛋白表达量均有不同程度下降;明显增加MCAO大鼠缺血侧脑组织AQP4与AQP9蛋白表达量。结论镇肝熄风汤预处理可抑制ET-1表达,增加AQP4与AQP9表达,减轻脑水肿程度。

镇肝熄风汤；梗死,中动脉,大脑；内皮素-1；水通道蛋白

传统中药在过去的几千年中积累丰富的治疗脑卒中的临床经验［1］。镇肝熄风汤是治疗中风的常用方剂,临床上也常用于高血压病属肝肾阴亏、肝阳上亢者,在治疗原发性高血压及缺血性脑卒中方面有着确切的疗效。笔者对镇肝熄风汤的前期研究结果显示,该方具有减轻原发性高血压大鼠脑皮质神经元损伤的作用［2］。既往研究显示镇肝熄风汤预先使用具有良好的对抗缺血引起的神经细胞凋亡的作用［3］。由此,笔者推测应用镇肝熄风汤对缺血性脑卒中个体进行早期干预,可能会有着较好的治疗效果。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一种细胞快速调节自身体积和内部渗透压的水分子通道,其在脑水肿病理生理学机制中起到重要的作用。在脑内已发现的AQPs中,AQP4与AQP9是脑内表达量最多、与缺血性脑损伤发生后脑组织含水量增加密切相关的水通道蛋白［4-5］。内皮素(endothelin,ET)是一类生物活性多肽,主要分布于心血管、脑、肝等组织器官的内皮细胞中,具有强大的缩血管作用［6］。研究表明ET-1过量表达是导致缺血性脑损伤后AQP4与AQP9表达、脑组织含水量增加的重要因素［7］,故本实验在前期研究的基础上,进一步观察镇肝熄风汤预处理干预大脑中动脉梗死(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠后,对脑组织ET-1表达的影响,同时观察MCAO大鼠缺血侧脑组织AQP4与AQP9表达量的变化和不同剂量镇肝熄风汤对其的影响,以探讨镇肝熄风汤减轻局部脑水肿、改善神经功能的生物学基础。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级Wistar大鼠96只,体质量260～300 g,动物生产许可证号:SCXK(鄂)2011-0002,雌雄不限,由华中科技大学实验动物中心提供。ET-1免疫组织化学检测试剂盒(SABC,武汉博士德生物工程有限公司),兔抗大鼠AQP4多克隆抗体(Chemico, US),兔抗大鼠AQP9多克隆抗体(Chemico,US),兔抗大鼠β-actin多克隆抗体(Santa Cruz,US),蛋白杂交膜(Schleicher and Schuell)。

1.2 方法

1.2.1 镇肝熄风汤制备 处方:怀牛膝、代赭石各30 g,生龙骨、生牡砺、生龟甲、生杭芍、玄参、天冬各15 g,川楝子、生麦芽、茵陈各6 g,甘草4.5 g。药物由湖北中医药大学中药系提供,代赭石、生龙骨、生牡砺、生龟板先煎2 h,然后和其余药物用8倍纯化水常规煎煮3次,过滤,浓缩至生药1.5和3.0 g·mL-1,4℃储存备用。

1.2.2 动物分组与模型建立 模型制作参照Pantoni的线栓法制备大脑MCAO大鼠模型［8］。线栓法制备大脑中动脉梗塞的栓塞时间为1 h。假手术组除仅分离颈内外动脉,不闭塞大脑中动脉,其余手术步骤同模型组。将实验大鼠随机分为假手术组,模型组,低剂量镇肝熄风汤组,高剂量镇肝熄风汤组,每组24只。其中低、高剂量镇肝熄风汤组大鼠于MCAO术前14 d灌胃给予相当于生药1.5,3.0 g.mL-1镇肝熄风汤,假手术组和模型组大鼠灌胃给予纯化水,每100 g体质量给予1 mL,bid,共14 d。

1.2.3 行为学观察 实验动物在术后6 h被随机分为4组,每组8只,参照SLAVIANKA等［9］方法进行行为学检测。评分标准:①提鼠尾观察前肢屈曲情况,如双侧前肢对称伸向地面,计为0分；如手术的对侧前肢出现腕屈、肘屈曲、肩内旋或既有腕肘屈曲又有肩内旋者,分别计为1,2,3,4分。②将动物置于平地面上,分别推双肩向对侧移动,检查阻力,如双侧阻力对等且有力,计为0分；如向手术的对侧推动时阻力下降者,根据下降程度的不同分为轻、中、重三度,分别计为1,2, 3分。③将动物双前肢置于一金属网上观察双前肢的肌张力,双前肢肌张力对等且有力者计为0分；同样根据手术对侧肌张力下降程度不同计为1,2,3分；④动物有不停向一侧转圈者,计为1分。根据标准评分,满分为11分,分数越高,动物行为障碍越严重。

1.2.4 称质量法检测脑组织含水量 各组取8只大鼠断头取脑,左右分开,分别称定左右脑湿质量。105℃烘烤48 h至恒重,精确称定干质量,计算含水量［9］。含水量(%)＝(湿重-干重/湿重)×100%。

1.2.5 免疫组织化学法检测ET-1分布及表达 收集各组8只大鼠缺血脑组织,切除部分端脑组织,置4%多聚甲醛固定、脱水、包埋后进行切片,采用链霉亲和素-生物素复合物(streptavidin-biotincomplex,SABC)法,以磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)代替一抗作阴性对照。ET-1蛋白检测一抗(兔抗大鼠ET-1),二抗(生物素标记山羊抗兔lgG)。染色步骤按照免疫组化试剂盒说明进行。结果判定:阳性反应为深棕色颗粒,计算ET-1阳性细胞数。阴性对照,染色时不加入一抗,结果为阴性。

1.2.6 Western blot检测AQP4与AQP9蛋白表达量 取缺血侧脑组织100 mg,用预冷的PBS缓冲液洗涤2次后加入适量细胞裂解液匀浆,吹匀于4℃放置30 min,12 000 r·min-1离心20min,留取上清液,取少量上清液采用考马斯亮蓝法检测浓度,将所有蛋白样品调至等浓度,-70℃保存。12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,转膜后以电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)发光试剂盒检测AQP4和AQP9蛋白的表达。兔抗大鼠AQP4多克隆抗体、兔抗大鼠AQP9多克隆抗体(1∶400),兔抗大鼠β-actin多克隆抗体(1∶750)作为内参。4℃摇匀过夜,加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗兔-IgG二抗(1∶1 000),室温轻摇1 h。HRP-ECL发光法显色。结果用凝胶成像分析系统测定蛋白条带相对吸光度值(即目的片段吸光度值/内参照吸光度值),使用BandScan5.0版软件测定,每组实验均重复3次以上。

2 结果

2.1 大鼠行为学检测 行为学检测结果显示,与假手术组比较,模型组和低、高剂量镇肝熄风汤组大鼠行为学积分均显著增加(P<0.01)；但与模型组比较,不同剂量镇肝熄风汤均可有效改善大鼠行为学积分(P< 0.05)。见表1。

2.2 脑组织含水量检测 脑组织含水量检测结果显示,模型组大鼠缺血侧脑组织含水量较假手术组大鼠有非常显著的增加(P<0.01)；不同剂量的镇肝熄风汤预先使用均可明显改善MCAO大鼠缺血侧脑组织含水量(P<0.05)。见表1。

2.3 镇肝熄风汤对缺血脑组织ET-1蛋白表达的影响 免疫组织化学检测结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧脑组织中ET-1含量显著升高(P< 0.01)；高、低剂量镇肝熄风汤组MCAO大鼠缺血侧脑组织中ET-1含量下降,且与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1,图1。

2.4 缺血侧脑组织AQP4与AQP9蛋白表达量检测 Western blot检测结果显示,模型组大鼠缺血侧脑组织AQP9蛋白表达量较假手术组大鼠有非常显著的增加(P<0.01),但AQP4蛋白表达量较假手术组大鼠增加无显著；低、高剂量镇肝熄风汤预先使用可明显增加MCAO大鼠缺血侧脑组织AQP4与AQP9蛋白表达量(P<0.05),以高剂量镇肝熄风汤作用更为显著。镇肝熄风汤对MCAO大鼠缺血侧脑组织AQP4与AQP9蛋白表达量的影响见图2。

表1 4组大鼠行为学积分、缺血侧含水量、缺血对侧含水量及ET-1蛋白表达的比较Tab.1 Comparison of behavioral integral,water content in ischemic cerebral tissues and contralateral cerebral tissues,as well as ET-1 protein expression among four groups of rats ±s

表1 4组大鼠行为学积分、缺血侧含水量、缺血对侧含水量及ET-1蛋白表达的比较Tab.1 Comparison of behavioral integral,water content in ischemic cerebral tissues and contralateral cerebral tissues,as well as ET-1 protein expression among four groups of rats ±s

与模型组比较,*1P<0.05,*2P<0.01Compared with model group,*1P<0.05,*2P<0.01

组别大鼠/只剂量/ (g·kg-1)行为学积分/分缺血侧含水量/%缺血对侧含水量/% ET-1阳性细胞百分数/%镇肝熄风汤低剂量组8 15 6.22±1.42*182.05±0.64*177.05±0.59 24.32±6.76*2高剂量组8 30 5.93±2.10*280.27±0.75*176.87±0.48 17.44±5.24*2模型组8…8.44±2.01 89.62±0.77 77.62±0.63 56.24±8.18假手术组8…0.00±0.00*275.21±0.49*275.15±0.55 6.15±0.94*2

图1 4组大鼠缺血侧脑组织ET-1蛋白表达(SABC,×400)A.假手术组;B.模型组;C.低剂量镇肝熄风汤组;D.高剂量镇肝熄风汤组Fig.1 ET-1 protein expression in ischemic cerebral tissues in four groups of ratsA.shamoperation group;B.model group;C.low-dose zhenganχifeng decoction;D.high-dose zhengan ifeng decoction

图2 镇肝熄风汤对MCAO大鼠缺血侧脑组织AQP4与AQP9蛋白的影响A.假手术组;B.模型组;C.低剂量镇肝熄风汤组;D.高剂量镇肝熄风汤组;与模型组比较,*1P<0.01,*2P<0.05

3 讨论

脑组织含水量调节对维持中枢神经系统正常的生理功能至关重要。脑水肿是缺血性脑卒中发生、发展过程中的重要病理现象,是局部脑缺血性损伤、脑梗死面积扩大的重要原因。既往研究显示,一侧大脑中动脉闭塞后,病灶侧大脑含水量可显著增加,脑水肿程度是重要的早期脑损伤指标,并对脑损伤的发展有预测作用,而AQPs在脑水肿的发生发展的分子机制中发挥着重要的作用［10］。AQP4是脑内表达最多的AQP［11］,广泛存在于脑组织,主要分布于星形胶质细胞、室管膜细胞、脉络丛等部位［12-13］,参与脑脊液重吸收、渗透压调节,并兼有细胞外渗透压感受器和水平衡调节器的功能［14］,在脑组织水的运输调节中起着重要作用。AQP9属于水甘油通道,在脑组织中含量丰富,主要存在于室管膜细胞以及下丘脑内侧基底部,分布于脑组织星型胶质细胞、血管内皮细胞和儿茶酚胺类神经元的胞膜上［15-18］,具有相对选择通透性,与组织中水的转运,水电解质的平衡调节有关,并参与调节中枢神经系统细胞外间隙与体循环之间的信号传递［19-22］。由于细胞水通道蛋白是组织细胞的水液代谢的重要调控者,故脑组织中主要水通道蛋白AQP4和AQP9的表达对异常的水液代谢有着重要的作用［23］。

本次实验显示,阻断MCA 6 h后,所有动物均出现不同程度的运动障碍。与模型组比较,在MCAO前预先使用不同剂量镇肝熄风汤均可有效改善大鼠行为学积分。MCAO大鼠脑组织含水量缺血侧脑组织含水量较假手术组大鼠有非常显著的增加,但不同剂量的镇肝熄风汤预先使用均可明显减少MCAO大鼠缺血侧脑组织含水量。结果提示预先使用镇肝熄风汤对局灶性脑缺血引起的中枢神经系统损伤及相应的行为学变化具有一定的改善作用。与假手术组比较,MCAO模型组大鼠在脑缺血6 h后,缺血侧脑组织中ET-1蛋白质表达有显著性升高,并与脑水肿程度呈正比,这与BARONE等［24］研究结果一致,而镇肝熄风汤高、低剂量干预组MCAO大鼠缺血侧脑组织中ET-1表达量均有不同程度下降。

MCAO模型组大鼠缺血6 h后缺血侧脑组织AQP4蛋白表达量与假手术组比较差异无统计学意义,而AQP9蛋白表达量有非常显著的增加,这与LO等［7］研究结果一致,推测缺血急性期即出现局部组织水代谢障碍,但在脑组织中表达量最大的AQP4蛋白表达改变不显著。因此,AQP9蛋白应激性表达增加并不足以调节局部水液代谢障碍,以致脑水肿程度不断加重。而镇肝熄风汤预先使用可明显增加MCAO大鼠缺血侧脑组织AQP4与AQP9蛋白表达量。

综上所述,镇肝熄风汤可能通过下调急性局部脑缺血性损伤后产生ET-1的作用影响缺血后脑组织AQP4与AQP9表达,发挥其减轻脑水肿、改善神经功能的作用。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.012

Effect of Zhengan Xifeng Decoction Pretreatment on Endothelin-1 and Aquaporin Expression in Cerebral Tissue of Middle Cerebral Artery Occlusion Rats

WU Yan-xia1,LI Xiu-juan1,MA Wei2
(1.Department of Geriatrics;2.Center of Eχperimental Medicine, Wuhan First Hospital,Wuhan 430022,China)

Objective To study the neuroprotective effect ofzhenganχifengdecoction(ZGXFD),a tranditional Chinese herbal compound,on conscious ratswithmidd le cerebral artery occlusion(MCAO).MethodsThe ratmodel of focalcerebral ischemia was established with the suture-occuluded method and was treated with different doses of ZGXFD(1.5 and 3 g·mL-1,respectively)before MCAO.The effect of ZGXFD on the behavior disorder and extent of cerebral edema of the MCAO rats were detected.ET-1 expression in the rat brain tissues was examined by immunohistochemistry method.The AQP 4 and AQP 9 expression were determined by Western blotting.ResultsA fter MCAO,different degrees of behavior disorder appeared in all rats.Pretreatmentwith ZGXFD improved the grade of behavior disorder of the rats,reduced the extent of cerebral edema,and increased AQP4 and AQP9 obviously.After MCAO,the tissue ET-1 expression was increased obviously but the ZGXFD could reverse it.Compared with the MCAO group,the AQP9 protein expression significantly increased after 6 h of hypoxiawhile the AQP4 did not change.ConclusionThese findings suggest that ZGXFD can directlymodulate ET-1,AQP4 and AQP9 expression and reduce cerebral edema.

Zhenganχifengdecoction;Occlusion,middle artery,cerebral;Endothelin-1;Aquaporin

R285

A

1004-0781(2014)02-0179-05

2013-05-15

2013-08-19

*湖北省科技厅科技攻关计划(2007AA301B09-3)

吴艳霞(1972-),女,湖北武汉人,副主任医师,博士,主要从事老年心脑血管疾病方面的研究。电话:(0) 13871557955,E-mail：spring_w@126.com。