参杞强精胶囊对免疫抑制小鼠免疫功能的影响*

田元春，张泉，雷崇忠，陆桂丽

(1．广西中医药大学第一附属医院药学部，南宁 530023；2．桂林三金药业股份有限公司，桂林 541004)

参杞强精胶囊对免疫抑制小鼠免疫功能的影响*

田元春1，张泉2，雷崇忠2，陆桂丽1

(1．广西中医药大学第一附属医院药学部，南宁 530023；2．桂林三金药业股份有限公司，桂林 541004)

目的观察参杞强精胶囊对环磷酰胺免疫抑制小鼠免疫功能的影响。方法60只实验小鼠随机分为6组,正常组,模型组,参杞强精胶囊高、中、低剂量组(给予参杞强精1.0,0.5,0.25 g·kg-1)和阳性对照组(给予左旋咪唑0.05 g·kg-1),除空白组外,其他组皮下注射环磷酰胺(50mg·kg-1)建立免疫抑制小鼠模型。各组连续给药10 d后,检测小鼠外周白细胞数、免疫器官脏器指数、碳粒廓清能力、淋巴细胞转化率、血清溶血素含量。结果参杞强精胶囊各剂量组小鼠的外周白细胞数量、碳粒廓清能力、淋巴细胞转化率、血清溶血素含量均明显提高(P<0.05或P<0.01),与模型组比较差异有统计学意义;高剂量参杞强精胶囊明显提高胸腺和脾脏指数(P<0.05)。结论参杞强精胶囊对免疫抑制小鼠的免疫功能有正调节作用。

参杞强精胶囊；免疫功能；环磷酰胺

参杞强精胶囊由菟丝子、党参、枸杞、五味子、黄芪、续断、当归等中药组成,具补肾健脾、活血养血、生精强精之功,临床治疗男性少、弱精子症。《素问·六节藏象论》云“肾者,主蛰,封藏之本,精之处也”,《素问·金匮真言论》曰:“夫精者,身之本也,故藏于精者,春不病温”,《脾胃认·脾胃盛衰论》谓“百病皆由脾胃衰而生也”,《金匮要略》谓“四季脾旺不受邪”,说明肾和脾与免疫功能密切相关。该方补肾健脾,在免疫调节方面应具有积极的作用。影响男性生殖的因素很多,遗传、病原微生物感染、环境污染、肥胖、心理、辐射、化学治疗等单个或者多个因素共同作用均可使精液质量下降造成不育［1-3］,提升机体免疫功能有益于男性少、弱精的治疗。前期研究表明,参杞强精胶囊能明显提高弱精子症模型动物的精子质量、提高大鼠附睾中超氧化物歧化酶活性、降低氧化应激损伤［4］。环磷酰胺为目前广泛应用的烷化剂,其副作用主要表现为免疫抑制。本实验探讨参杞强精胶囊对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响,为其进一步应用与开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 参杞强精胶囊,由广西中医药大学第一附属医院制剂室提供,批号:20111028；盐酸左旋咪唑片,广东南国药业有限公司生产,批号:110103。羧甲基纤维素钠,广东江门赫克力士化工有限公司生产,批号:091024。环磷酰胺,通化茂祥制药有限公司生产,批号:110604。植物血凝素,Sigma公司。印度墨汁,北京西中化工厂。豚鼠血清:无菌采豚鼠血,分离血清置-20℃备用。鸡血红细胞(chicken red blood cell,CRBC)混悬液制备:于无菌操作下,自鸡翼下静脉采血,置100 mL锥形瓶中,加入相当于鸡血体积5倍的Alserver′s溶液,混匀,4℃冰箱贮存。临用时用0.9%氯化钠溶液洗涤2次,每次离心速度为3 000 r·min-1,离心10 min至CRBC压积值恒定,弃去上清液和界面,直至按此值用0.9%氯化钠溶液配成5%CRBC。

1.2 动物 SPF级昆明种小鼠,体质量18～22 g,雌雄各半,广西医科大学实验动物中心提供,动物生产许可证:SCXK(桂)2003-0003,试验动物使用许可证: SYKG(桂)2003-0005。小鼠分笼饲养,饲料为标准固定鼠料,自由进食、饮水,自然昼夜节律光照。饲养条件:饲养室面积30 m2,工作照度:150～300 lx,动物照度:150～200 lx,氨浓度≤14 mg·(m3)-1,室温(22± 1)℃,相对湿度(50±10)%,通过导流风机与外界对流通风换气。

1.3 仪器 EL204型电子天平［梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司］,恒温水浴箱(江苏恒丰仪器制造有限公司),756紫外可见分光光度计(上海普华科技仪器有限公司),BIOFUGE28RS型低温高速离心机(德国HERAEUS生产),LH50A显微镜(Olympus),YXQSG41-280型高压蒸汽消毒器(上海医用仪器制造)。

1.4 动物分组与给药 小鼠60只,随机分为6组,即正常组,模型组,参杞强精胶囊高、中、低3个剂量组和阳性对照组。采用灌胃方式给药,药物用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成混悬液,现配现用。正常组及模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠(溶剂)10 mL·kg-1,参杞强精胶囊高、中、低剂量组按1.0,0.5, 0.25 g·kg-1给药,阳性对照组给予左旋咪唑0.05 g·kg-1,每日给药1次,连续10 d,每次0.4 mL。除正常组外,各组在第1,2,3天皮下注射环磷酰胺50 mg·kg-1造成免疫功能低下模型。

1.5 对外周血白细胞总数及胸腺、脾脏指数的影响 各组小鼠给药10 d后,尾部取血,血细胞计数板观察计数白细胞(white blood cell,WBC)。于末次给药后1 h(禁食不禁水8 h),称取小鼠体质量,同时各组小鼠脱颈椎处死,取脾脏、胸腺,用滤纸吸干脏器表面血污,称质量并计算脾和胸腺指数。脾(或胸腺)指数＝脾(或胸腺)质量(mg)/体质量(g)［5-6］。

1.6 对单核巨噬细胞吞噬功能的影响 采用碳粒廓清法。于末次给药30 min后,经小鼠尾静脉注入3倍稀释的印度墨汁0.05mL·(10 g)-1。分别于1min和5min从眶后取血20μL,并将其加入到0.1%碳酸钠溶液2 mL中摇匀,在分光光度计680 nm波长处测吸光度(A)值。根据公式计算廓清指数(K),K值经体质量及肝、脾质量换算后,得吞噬指数α。K＝(lgA1-lgA2)/(t2-t1),A1表示1 min的A值,A2表示5 min的A值。吞噬指数(α)＝体质量/(肝质量+脾质量)×K1/3［6-7］。

1.7 对淋巴细胞转化率的影响 各组小鼠于给药前的第1～3天,肌内注射植物凝集素10 mg·kg-1,于末次给药后2 h,小鼠断尾取血至玻片一端,另取一载玻片推片,自然干燥后,Giemsa-Wright染液染色,再用0.9%氯化钠溶液冲洗,用滤纸将标本吸水干燥后,镜检。每片计数100个淋巴细胞,记录转化和未转化的淋巴细胞数,按公式计算淋巴细胞转化率。淋巴细胞转化率(%)＝转化淋巴细胞/(转化淋巴细胞+未转化淋巴细胞)×100%［6］。

1.8 对血清溶血素水平的影响 各组小鼠于给药第4天,腹腔注射5%CRBC 0.3 mL免疫,末次给药后24 h,每鼠从眼眶后静脉丛取血约0.5 mL, 3 000 r·min-1离心,取血清20μL加入盛有0.9%氯化钠溶液1.0 mL试管内,加入5%CRBC 0.5 mL,再加1∶10豚鼠血清稀释液0.5 mL,混匀置37℃水浴中保温30 min,取出,冰水浴10 min终止反应,转速2 000 r·min-1离心10 min,取上清液1.0 mL,加都氏液3.0 mL混匀,静置10 min,在波长546 nm处比色,用A值表示血清溶血素含量［6-7］。

1.9 统计学方法 数据应用SPSS 12.0版统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对白细胞总数及胸腺、脾脏指数的影响 结果见表1。由表1可见,模型组WBC水平、胸腺和脾脏指数降低,与正常组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),提示造模成功。参杞强精胶囊各剂量组WBC水平均提高,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；参杞强精胶囊给药后,胸腺和脾脏指数比模型组有改善,中、高剂量胸腺指数与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05),高剂量组的脾脏指数与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 6组小鼠外周血白细胞总数及胸腺、脾脏指数的测定值Tab.1 Determination results of total peripheralwhite blood cells and indexes of thymus and spleen in six groups ofmine ±s

表1 6组小鼠外周血白细胞总数及胸腺、脾脏指数的测定值Tab.1 Determination results of total peripheralwhite blood cells and indexes of thymus and spleen in six groups ofmine ±s

与模型组比较,*1P<0.05,*2P<0.01;与正常组比较,*3P<0.01,*4P<0.05Compared with model group,*1P<0.05,*2P<0.01;compared with normal group,*3P<0.01,*4P<0.05

组别小鼠/只剂量/ (g·kg-1) WBC/ (×109·L-1)胸腺指数脾脏指数(mg·g-1)参杞强精胶囊低剂量组10 0.25 5.6±0.8*11.90±0.43 4.29±0.98中剂量组10 0.5 6.3±1.3*22.11±0.45*14.66±1.35高剂量组10 1.0 7.1±1.2*22.25±0.58*15.09±1.16*1阳性对照组10 0.05 7.3±1.3*22.38±0.52*25.16±1.42*1模型组10…4.4±0.9*31.58±0.37*33.46±1.22*4正常组10…7.9±1.1 2.69±0.51 5.39±1.37

2.2 对单核巨噬细胞吞噬功能的影响 结果见表2。由表2可见,模型组廓清指数K和吞噬指数α降低,与正常组比较其差异有统计学意义(P<0.01)。参杞强精胶囊各剂量廓清指数K和吞噬指数α提高,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表2 6组小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的测定结果Tab.2 Determination results of phagocytosis by mononuclear macrophage in six groups of mice ±s

表2 6组小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的测定结果Tab.2 Determination results of phagocytosis by mononuclear macrophage in six groups of mice ±s

与模型组比较,*1P<0.05,*2P<0.01;与正常组比较,*3P< 0.01Compared with model group,*1P<0.05,*2P<0.01;compared with normal group,*3P<0.01

组别小鼠/只剂量/ (g·kg-1)廓清指数(K)吞噬指数(α)参杞强精胶囊低剂量组10 0.25 0.029±0.007*14.512±0.082*2中剂量组10 0.5 0.031±0.009*14.683±0.134*2高剂量组10 1.0 0.032±0.011*14.727±0.092*2阳性对照组10 0.05 0.041±0.006*24.933±0.067*2模型组10…0.021±0.009*34.299±0.101*3正常组10…0.072±0.008 7.384±0.085

2.3 对淋巴细胞转化率的影响 结果见表3,模型组淋巴细胞转化率下降,与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。参杞强精胶囊各剂量组淋巴细胞转化率提高,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01),中、高剂量组的淋巴细胞转化率恢复到正常组水平。

2.4 对血清溶血素水平的影响 结果见表3。由表3可见,模型组血清溶血素下降,与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。参杞强精胶囊各剂量组的血清溶血素提高,与模型组比较,差异有统计学意义(P< 0.01)。

3 讨论

本实验结果显示,参杞强精胶囊对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠有显著的防御白细胞下降作用,提升胸腺、脾腺指数,提示对环磷酰胺所致免疫器官的萎缩有较好的防御作用；明显提高廓清指数和吞噬指数,对网状内皮系统吞噬功能具有明显的激活、增强作用,提示参杞强精胶囊对小鼠非特异性免疫功能具有增强作用；还可明显改善环磷酰胺所致的小鼠血清溶血素含量降低现象,促进小鼠溶血素抗体生成,提高淋巴细胞转化率,呈一定量效关系,提示参杞强精胶囊可提高小鼠特异性体液免疫和细胞免疫功能。

据大量文献报道,结合广西中医药大学第一附属医院男科多年的临床经验,课题组认为肾虚、肝郁、脾虚、血瘀是少、弱精子症的基本病机,治疗上以健脾益肾法为主,健脾益肾、先后天同治,补肾疏肝、精血同治,通络活血、祛湿化瘀,以此理论为指导研制了参杞强精胶囊治疗少、弱精子症。笔者在本研究中初步观察参杞强精胶囊对免疫低下小鼠的影响,结果表明其对环磷酰胺免疫抑制小鼠有免疫增强功能,能改善非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫,同时增强免疫防御功能,其作用机制还有待深入研究。

表3 6组小鼠淋巴细胞转化率和血清溶血素水平的测定值Tab.3 Determination results of lymphocyte transformation rate and serumhemolysin content in six groups of mice ±s

表3 6组小鼠淋巴细胞转化率和血清溶血素水平的测定值Tab.3 Determination results of lymphocyte transformation rate and serumhemolysin content in six groups of mice ±s

与模型组比较,*1P<0.01;与正常组比较,*2P<0.01Compared with model group,*1P<0.05;compared with normal group,*2P<0.01

组别小鼠/只剂量/ (g·kg-1)淋巴细胞转化率/%A值参杞强精胶囊低剂量组10 0.25 39.44±6.15*10.093±0.012*1中剂量组10 0.5 40.58±3.46*10.125±0.014*1高剂量组10 1.0 41.93±4.81*10.140±0.017*1阳性对照组10 0.05 44.85±5.67*10.151±0.016*1模型组10…22.59±2.73*20.044±0.009*2正常组10…40.27±3.58 0.186±0.011

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.011

Influences of Shenqi qiangjing Capsule on the Immune Function of Immunosuppressed Mice

TIAN Yuan-chun1,ZHANG Quan2,LEI Chong-zhong2,LU Gui-li1
(1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Guangχi University of Chinese Medicine,Nanning 530023,China;2.Guilin Sanjin Pharmaceutical Co.Ltd.,Guilin 541001,China)

Objective To observe the immuno-regulatory effect ofshenqi qiangjingcapsule(SQQJC)on mice treated with cyclophosphamide.MethodsSixty mice were randomly divided into the control group,model group,positive group,SQQJC-high,mediumand low dose groups.Except in the control group,all mice were injected with cyclophosophamide(50 mg·kg-1).Mice in the SQQJC-high,mediumand low dose groups were administered with 1.0,0.5,and 0.25 mg·kg-1SQQJC,respectively.Mice in the control group were administered with solvent.Mice in the positive group were administered with levamisole for 10 days.Themice were examined for the total peripheralwhite blood cells,immune organ weight index,carbon particle clearance capability ofmacrophage,the lymphocyte transformation rate and the serumhemolysin content.ResultsCompared with the model group,the peripheral white blood cells,carbon particle clearance capability of macrophage,the lymphocyte transformation rate and the serumhemolysin contentwere significantly increased inmice treated with SQQJC at low,mediumand high doses(P<0.05 orP<0.01);the immune organ weight indexes were significantly increased in mice treated with SQQJC at high dose(P<0.05).ConclusionSQQJC can improve the immune function of the immunosuppressed mice.

Shenqi qiangjingcapsule;Immune function;Cyclophosphamide

R285.5

A

1004-0781(2014)02-0176-04

2013-03-20

2013-08-01

*广西壮族自治区卫生厅中医药医院制剂类课题(GZYZ-10-05)；广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项课题(GZYZ1101)

田元春(1971-),女,广西南宁人,副主任药师,学士,研究方向:临床药学和医院药学。电话:0771-5840015, E-mail：tianyc1989@163.com。