环维黄杨星D对大鼠心力衰竭的治疗作用

黄丹丹,邵靓婧,许立

(南京军区南京总医院 1.药品科;2.血液病科,南京 210002;3.南京中医药大学药学院,南京 210029)

环维黄杨星D对大鼠心力衰竭的治疗作用

黄丹丹1,邵靓婧2,许立3

(南京军区南京总医院 1.药品科;2.血液病科,南京 210002;3.南京中医药大学药学院,南京 210029)

目的 通过观察环维黄杨星D(CVB-D)对心力衰竭(心衰)大鼠心脏功能和心肌形态、结构的影响,探讨CVB-D对心衰的治疗作用。方法结扎SD大鼠冠脉左前降支复制大鼠心衰模型,随机分为5组,另加假手术组。应用超声心动仪检测心功能指标:左室后壁舒张期厚度(LVPWd)、左室后壁收缩期厚度(LVPWs)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期内径(LVIDd)、射血分数(EF)、心率(HR)、心输出量(CO)、左室短轴缩短率(LVSF)、每搏输出量(SV);制作心肌组织切片,苏木精-伊红(HE)染色观察心肌组织学改变,透射电镜观察心肌超微结构的变化。结果与模型对照组比较,CVB-D中、大剂量组EF、LVSF明显增加(P＜0.05或P＜0.01),CVB-D小、中剂量组可见SV增加(P＜0.05),CVB-D小、中、大剂量组显示CO增加(P＜0.05),CVB-D大剂量组显示LVIDs减少,LVPWs增加(P＜0.05)。光镜下CVB-D各剂量组使受损心肌组织出现不同程度的变化:心肌纤维排列逐渐整齐,横纹逐渐明显,轮廓逐渐清晰。透射电镜下心肌超微结构发生变化:CVB-D使受损心肌纤维断裂减少,线粒体数量增多、肿胀变性减轻。结论CVB-D对心衰大鼠心脏收缩、泵血功能有明显的改善作用,对心肌肌纤维、线粒体的损伤有缓解作用,推测CVB-D对心衰存在一定的治疗作用。

环维黄杨星D;心力衰竭;心功能

环维黄杨星D(Cyclovirobuxine D,CVB-D)为黄杨生物碱中主要的有效单体。我国研究环维黄杨星D已有40年,取得了不少成果。临床上广泛用于治疗心律失常、心绞痛、冠心病,尤其作为一种非苷类强心药受到普遍关注[1-4]。CVB-D对心血管系统作用广泛,对多种心血管疾病具有疗效好、口服用药安全、长期应用毒副作用低的特点,这些为进一步研究和开发CVB-D提供了良好的基础。笔者在本实验通过复制大鼠心力衰竭(心衰)模型,观察CVB-D对心衰大鼠心功能和心肌形态的影响,从而探讨CVB-D对心衰的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物 斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠:清洁级,雄性,250～280 g,南京医科大学实验动物中心提供。合格证号:SCXK(苏)2013-0005,使用许可证号:SYXK(苏)2012-0042。实验大鼠正常给予饲料,饮水,室温:20～25℃,相对湿度:60%～70%,保持通风。

1.2 试剂 CVB-D:类白色结晶,由南京小营药厂提供,纯度≥95%,批号:X091027。CVB-D难溶于水,溶于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS),加入微量冰醋酸(终浓度不超过0.1%)全部溶解后,调pH到7.2。溶媒对照组:PBS溶液,pH调到7.2;地高辛片(上海信谊药厂有限公司生产,规格:0.25 mg,批号:120103)。

1.3 仪器 Vevo770型高分辨小动物超声仪(加拿大Visualsonics公司),型号:ALC-V8型动物呼吸机(上海奥尔科特医疗仪器公司)。

1.4 造模与分组 结扎SD大鼠冠脉左前降支制造大鼠心衰模型:SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉,取仰卧位,固定四肢、牙齿于操作台上。钝性分离肌肉至气管,插入气管插管后接小动物呼吸机[1,5-6]。2周后检测超声心动,以射血分数(ejection fraction,EF)＜50%为造模成功。造模成功后心衰大鼠随机分为5组:模型对照组(12只),地高辛组(0.032 mg·kg-1)、CVB-D的小、中、大3个剂量(0.500,1.000,2.000 mg·kg-1)(各10只),另制备假手术组(8只),共计6组。连续灌胃60 d,qd,给药体积:10 mL·kg-1。

1.5 观察大鼠一般情况 存活率、饮食、活动情况等。

1.6 超声心动指标 左室后壁舒张期厚度(left ventricular posterior wall at end-diastole,LVPWd)、左室后壁收缩期厚度(left ventricular posterior wall at endsystole,LVPWs)、左室收缩末期内径(left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs)、左室舒张末期内径(left ventricular internal diameter at end-diastole, LVIDd)、EF、心率(heart rate,HR)、心排血量(cardiac output,CO)、左室短轴缩短率(left ventricular shortening fraction,LVSF)、每搏排血量(stroke volume,SV)。

1.7 病变严重程度 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察病变严重程度,轻度“+”,中度“++”,重度“+++”。

1.8 透射电镜观察 心肌纤维、肌节、线粒体、质膜等的变化。

2 结果

2.1 一般状况 心衰模型对照组大鼠于灌胃给药的第3天、第15天、第40天、第50天各死亡1只。地高辛组于给药的第10天死亡1只。CVB-D小剂量组于给药的第7天、第20天各死亡1只。CVB-D中剂量组于给药第10天和第28天各死亡1只。CVB-D大剂量组于给药第18天死亡1只。心衰大鼠随着造模时间的延长出现进食减少、活动量减少、腹水、足部水肿等。

2.2 心衰大鼠超声心动结果 与假手术组比较,模型对照组心衰大鼠EF、LVSF、SV、CO、LVPWs显著减少; LVIDd、LVIDs则显著增加(P＜0.05或P＜0.01)。与模型对照组比较,CVB-D中、大剂量组EF、LVSF明显增加(P＜0.05或P＜0.01),CVB-D小、中剂量组可见SV增加(P＜0.05);CVB-D小、中、大剂量组显示CO增加(P＜0.05),CVB-D大剂量组显示LVIDs减少, LVPWs增加(P＜0.05)。见表1。

2.3 HE染色 假手术组:心脏心肌细胞横纹清晰,未见增生肥大、萎缩、断裂,无细胞变性、坏死等病变,间质无水肿及炎性细胞浸润,心外膜、心内膜无异常。模型对照组:心脏大部分心肌细胞重度变性坏死(+++),间质纤维结缔组织重度增生(+++),伴轻度炎细胞浸润(+);部分心脏局灶性心肌细胞变性坏死(+),间质纤维结缔组织增生(+)。CVB-D小、中、大剂量给药组出现不同程度地变化,心肌纤维逐渐变细、肌纤维排列逐渐整齐,“分枝”状与“漩涡”状渐渐消失,细胞核染色变浅,相对均匀,且形状整齐。见图1。

2.4 透射电镜 假手术组肌纤维排列有序、紧密,肌节排列正常,Z线清晰,线粒体大小较一致,质膜清晰、完整,嵴清晰、致密。模型对照组肌纤维排列紊乱,绝大部分断裂,肌节萎缩、断裂、排列无序、肌丝溶解,线粒体数量减少,肿胀变性明显,质膜部分破裂,嵴明显减少、断裂、变短、杂乱分布。CVB-D大剂量组肌纤维排列有所改善,肌纤维断裂减少,线粒体数量增多,肿胀变性减轻。嵴增多,清晰度、致密度得到改善。见图2。

3 讨论

对于心衰的研究,无论是从治疗技术方面还是药物方面,最基本的就是建立心衰模型。复制动物心衰模型的方法有许多种:冠状动脉结扎法、冠状动脉堵塞法、主动脉缩窄法、动静脉瘘法、心脏瓣膜关闭不全法、药物损害法等[7]。本实验采用冠状动脉结扎法,结扎左前降支,造成心肌急性梗死,随着结扎时间的延长,心肌出现炎症反应,梗死区域心室壁变薄,可观察到左室腔扩大,心肌收缩力明显减弱。这类模型模拟心肌

梗死演变到心衰的病理过程,这一病理过程中心肌细胞、亚细胞的改变及心肌线粒体的变化与人类心衰相似[8]。此造模方法,相对其他方法而言,技术要求高,模型死亡率比一般方法高,造模时间相对长,其优点在于模拟人类心衰,用于药物研究更具有临床意义[9]。

表1 6组大鼠超声心动图检测指标比较Tab.1 Com parison of cardiac function by echocardiography among six groups of rats ±s

表1 6组大鼠超声心动图检测指标比较Tab.1 Com parison of cardiac function by echocardiography among six groups of rats ±s

与模型对照组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

组别大鼠/只剂量/ (mg·kg-1) EF LVSF % SV/ μL HR/ (次·min-1)假手术组8…74.92±3.59*145.27±3.23*1229.42±47.09*2393.87±72.90模型对照组8…36.78±10.77 18.88±6.12 181.64±36.57 422.50±49.79地高辛组9 0.032 51.23±8.80*227.74±5.72*1249.73±47.09 431.12±22.79 CVB-D小剂量组8 0.500 46.49±9.39 24.67±5.69 227.51±39.54*2420.00±87.78中剂量组8 1.000 50.84±11.97*227.57±7.45*2229.11±37.28*2414.62±57.10大剂量组9 2.000 53.10±5.15*128.82±3.43*1mm假手术组96.95±23.63*22.01±0.15 3.17±0.23*27.56±0.77*14.14±0.57*1256.66±35.88 385.25±92.71组别CO/ (mL·min-1) LVPWd LVPWs LVIDd LVIDs模型对照组70.98±15.97 2.02±0.18 2.70±0.33 9.56±0.97 7.79±1.31地高辛组76.60±7.49*22.12±0.33 3.08±0.41*29.40±0.72 6.81±0.98 CVB-D小剂量组94.73±24.16*21.94±0.20 3.06±0.18 9.49±1.39 7.21±1.54中剂量组95.94±25.53*21.91±0.26 3.05±0.46 9.14±0.97 6.67±1.34大剂量组95.21±28.45*22.07±0.24 3.41±0.42*29.31±0.68 6.64±0.68*2

A.假手术组;B.模型对照组;C.地高辛组;D.CVB-D小剂量组;E.CVB-D中剂量组;F.CVB-D大剂量组图1 6组大鼠心脏组织HE染色图(×200)A.sham group;B.model group;C.digoxin group;D.low-dose CVB-D group;E.middle-dose CVB-D group;F.high-dose CVB-D groupFig.1 HE staining on cardiac tissue of six groups of rats(×200)

A.假手术组;B.模型对照组;C.地高辛组;D.CVB-D大剂量组图2 4组大鼠心脏组织透射电镜检查结果(×25 000)A.sham operation group;B.model group;C.digoxin group;D.high-dose CVB-D groupFig.2 Detection results of cardiac tissue in four groups of rats by transm ission electron m icroscopy(×25 000)

采用超声心动指标来诊断大鼠心衰模型是否成功,同时采用超声心动相关指标及参数的改变来评价药物对心衰大鼠的疗效[10]。此方法是一个无创伤性的检验方法,避免了因为创伤而导致的误差[11],而且又可以连续动态观察模型动物的心功能状态,因此超声心动图能很好地评价心衰动物模型的成功与否,科学实验中值得推广和使用。实验发现:模型对照组大鼠的心功能较假手术组有显著下降,模型对照组大鼠心脏射血分数EF＜47%,假手术组大鼠心脏射血分数EF＞70%,差异有统计学意义,表明造模成功。造模成功后给药,CVB-D小、中、大(0.500,1.000和2.000 mg·kg-1)3个剂量组,给药60 d后结果显示CVB-D对心衰大鼠心脏收缩和泵血功能有明显的改善作用,从而推测CVB-D对心衰存在一定的治疗作用。

实验中发现:CVB-D使受损的心肌组织发生了形态学改变,主要表现为肌纤维排列整齐,横纹出现且轮廓清晰,心肌细胞变性坏死减轻。同时受损心肌超微结构发生变化:肌纤维断裂减少,线粒体数量增多,肿胀变性减轻。嵴增多,清晰度、致密度得到改善。线粒体对心肌细胞生理功能的维持具有重要作用,同时线粒体的氧化代谢与心肌收缩的能源和张力密切相关,其线粒体结构的完整性与心肌功能紧密相连。因此, CVB-D能够改善受损心肌的形态和结构,对心衰的心脏起到一定的改善作用。

综上所述,CVB-D对大鼠的心衰有一定治疗作用,此作用与改善心功能,改善心肌形态和结构有关。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.006

Therapeutic Effects of Cyclovirobuxine D on Rats with Heart Failure

HUANG Dan-dan1,SHAO Jing-jing2,XU Li3
(1.Department of Pharmacy;2.Department of Hematology, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command,Nanjing 210002,China;3.School of Pharmacy, Nanjing University ofChinese Medicine,Nanjing 210029,China)

Objective To explore the therapeutic effect of cyclovirobuxine-D(CVB-D)on heart failure by observing the influences of CVB-D on cardiac function,myocardialmorphology and structure in ratswith heart failure.MethodsThe rat model of heart failure was established by ligating left anterior descending coronary artery,and then the ratswere randomly divided into 5 groups,plus the sham group.Echocardiography was used to assess cardiac function,including EF,LVSF,SV,HR,CO and so on.Myocardial tissue section was obtained.Change in the myocardial tissue was observed by HE staining.Myocardial ultrastructure was observed by using transmission electronmicroscope.ResultsAs compared with themodel group,EF and LVSF were significantly increased inmedium and high dose CVB-D groups(P＜0.05 orP＜0.01),SV was increased in low andmedium dose CVB-D groups(P＜0.05),CO was increased in low,medium and high dose CVB-D groups(P＜0.05),LVIDs was decreased and LVPWs was increased in high dose CVB-D group(P＜0.05).Under light microscope,changes of myocardial structureswere observed in different CVB-D dose groups:myocardial fiber gradually became tidy,stripes became clear,and contour became clear.The changes of myocardial ultra-structure were observed under transmission electron microscope:the myocardial fiber breakage was reduced and the number ofmitochondria was increased,swelling degeneration was alleviated.ConclusionCVB-D significantly improved cardiac contraction and blood pumping function of rats with heart failure,exerted mitigative effect on damage of cardiacmuscle fiber and mitochondria.It suggests that CVB-Dmay be effective in the treatment of heart failure.

Cyclovirobuxine D;Heart failure;Heart function

R285.5;R541

A

1004-0781(2014)12-1562-04

2013-12-25

2014-04-17

黄丹丹(1982-),女,江苏南通人,药师,硕士,研究方向:临床药学。电话:(0)13404166202,E-mail: huangdandan2002@sohu.com。

许立(1964-),男,江苏南通人,教授,博士,研究方向:药理学。电话:(0)13851572203,E-mail:xuli64@163. com。