绞股蓝皂苷对2型糖尿病并发非酒精性脂肪性肝病大鼠脂质过氧化的影响*

贺琴,李芳,谭华炳

(湖北医药学院附属人民医院1.感染性疾病科肝病研究室;2.药学部,十堰 442000)

绞股蓝皂苷对2型糖尿病并发非酒精性脂肪性肝病大鼠脂质过氧化的影响*

贺琴1,2,李芳1,谭华炳1

(湖北医药学院附属人民医院1.感染性疾病科肝病研究室;2.药学部,十堰 442000)

目的 观察绞股蓝皂苷(GPS)对2型糖尿病(T2DM)并发非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠脂质过氧化和肝损伤的影响。方法65只SPF级雄性SD大鼠随机分为空白对照组(N组),NAFLD模型组(NM组),T2DM并NAFLD模型组(M组),T2DM并NAFLD模型大鼠再分别给予GPS(1 g·kg-1·d-1)干预(JH组),GPS (0.5 g·kg-1·d-1)干预(JL组),而M组以纯净水灌胃作为对照。检测血糖(BS)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、脂联素(ADP);检测肝组织TG、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。结果ADP结果:N组、M组、NM组、JH组、JL组依次为(7.46±1.12),(3.58±0.98),(4.89±1.02),(4.79± 1.01),(4.13±0.89)ng·mL-1,JH组、JL组高于M组(P＜0.01),JH组高于JL组(P＜0.05)。MDA结果:N组、M组、NM组、JH组、JL组依次为(2.98±0.09),(4.22±0.11),(3.66±0.10),(3.72±0.11),(3.99±0.13)nmol·mL-1,JH组、JL组低于M组(P＜0.01),JH组低于JL组(P＜0.05)。SOD结果:N组、M组、NM组、JH组、JL组依次为(240.8±17.4), (149.9±20.6),(181.6±19.4),(209.8±19.2),(189.4±18.9)U·mL-1,JH组、JL组高于M组(P＜0.01),JH组高于JL组(P＜0.05)。肝组织TG结果:N组、M组、NM组、JH组、JL组依次为(28.98±1.68),(214.46±5.44),(198.46±6.98), (142.87±6.64),(164.92±7.56)mg·g-1;JH组、JL组低于M组(P＜0.01),JH组低于JL组(P＜0.05)。ALT、AST结果:与M组比较,JH组、JL组ALT、AST下降,差异有统计学意义(P＜0.01),JH组低于JL组(P＜0.05)。结论GPS能降低T2DM并NAFLD大鼠脂质过氧化程度,通过抑制脂质过氧化抑制肝损伤。

绞股蓝皂苷;糖尿病,2型;肝病,脂肪性,非酒精性;脂质过氧化;损伤,肝

到2025年我国将有2亿人罹患糖尿病[1],其中约95%为2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)。T2DM与非酒精性脂肪性肝病(nonalcohol fatty liver disease,NAFLD)互为因果:T2DM患者NAFLD检出率为50.45%[2]。NAFLD通过非酒精性脂肪性肝炎(non alcoholic steatohepatitis,NASH)发展为NASH相关肝硬化、肝癌[3-4]。NAFLD导致高脂血症、动脉粥样硬化、T2DM[5-7]。NAFLD的“二次打击”学说认为,肥胖、T2DM、高脂血症等伴随的胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)导致第一次打击;脂质过量沉积的肝细胞发生氧化应激和脂质过氧化,导致线粒体功能障碍、炎症递质产生,肝星状细胞的激活,产生肝细胞的炎症坏死和纤维化是第二次打击[8]。针对T2DM并发NAFLD,既要关注第一次打击,还要关注第二次打击。研究发现,绞股蓝皂苷(gypenosides,GPS)能降低T2DM并NAFLD大鼠三酰甘油(triglycerides,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、血糖(blood sugar, BS)[9],下调肝组织肿瘤坏死因子-αmRNA(tumor necrosis factor alphamRNA,TNF-αmRNA)表达[10],抑制肝组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARγ)表达的下降,且呈剂量依赖性[11]。笔者通过检测肝组织TG、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、血脂联素(adiponectin, ADP)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartale aminotransferase,AST),观察GPS是否通过抗脂质过氧化作用干预NAFLD程度、预防NASH导致的肝损害。

1 材料与方法

1.1 动物 65只SPF级雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠,体质量220～250 g,由湖北医药学院动物实验中心提供,合格证号:SCXK(湘) 2009-0004。实验场地:湖北省十堰市实验动物中心,实验动物设施使用证明号:00015644。

1.2 实验饲料 普通饲料由湖北医药学院动物实验中心提供。胆固醇购自北京双旋生物培养基制品厂。猪油由市售板油自行炼制而成,蛋黄粉由市售鸡蛋自行制作。高糖高脂饲料由湖北医药学院动物实验中心按实验配方配制成成品使用(配方:78%普通饲料+ 2.5%胆固醇+8%蛋黄+7%猪油+4.5%蔗糖)。高脂饲料由湖北医药学院动物实验中心按照实验设计配方配制成成品使用(配方:82.5%普通饲料+2.5%胆固醇+8%蛋黄+7%猪油)。

1.3 试剂 BS、TG、TC、ALT、AST检测试剂为瑞士Roche/Hitache公司原装进口试剂,SOD、MDA检测试剂购自南京建成科技有限公司。血清脂联素ELISA试剂盒为GBD公司生产(检测范围0～50 ng·mL-1)。链尿佐菌素(streptozotocin,STZ)购于美国Sigma公司。GPS购自安康东科麦迪森天然药业有限公司,纯度为98%。

1.4 仪器 Hitache7600全自动生化检测仪(瑞士Roche公司)。DL-45R-L冷冻低温离心机(上海中科生物医学高科技开发有限公司)。紫外光分光光度计(北京北方华粤贸易有限公司)。德国组织匀浆机。

1.5 实验模型的建立 参照文献[12],大鼠普通饲料饲养观察1周,动物无死亡及不良反应。按实验设计将65只大鼠分为空白对照组(N组,7只),NAFLD模型组(NM组,7只),T2DM并NAFLD模型组(51只)。模型组每鼠每天高糖高脂饲料约20 g,分两次投入,喂养4周,大鼠隔夜空腹腹腔注射STZ 40 mg·kg-1,48 h后尾静脉取血,血糖＞11.1 mmol·L-1,纳入实验组,造模成功率为100%;继续予高糖高脂饲料喂养至8周,建立T2DM并NAFLD模型。期间大鼠死亡15只。将T2DM并NAFLD模型大鼠分为GPS大剂量组(JH组,9只)予以GPS1 g·kg-1·d-1灌胃;GPS小剂量组(JL组,9只)予以GPS 0.5 g·kg-1·d-1灌胃;模型对照组(M组,9只)予同等体积的纯化水灌胃。继续给予高糖高脂饲料,自由饮水。治疗周期为6周;实验周期14周。N组每天给予普通饲料约20 g(根据NAFLD组进食量调整);NM组予以高脂饲料约20 g(依据前一天进食量决定第2天进食量),饲料分2次投入,自由饮水。实验周期14周。

1.6 标本的采集与检测

1.6.1 血液标本的采集与处理 参照文献[9]。

1.6.2 肝组织匀浆的制备 在肝脏最大叶边缘0.5 cm处取小块肝组织一块,冰0.9%氯化钠溶液冲洗,滤纸吸干,称取0.5 g置于预冷的0.9%氯化钠溶液5 mL,迅速用内切式匀浆机4 000 r·min-1匀浆每次10 s,间隙30 s,连续3次,碎冰块中制成10%的肝匀浆,高速冷冻离心机4℃、3 000 r·min-1离心10 min,取上清液3 mL密封,-20℃冷冻待检。

1.6.3 肝组织SOD、MDA的检测 取肝组织匀浆,分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法,按试剂说明书逐步进行。

1.6.4 ADP检测 取适量血清分别严格按试剂盒说明书测定空腹ADP,ADP测定采用酶联免疫法。

1.6.5 肝组织匀桨TG测定 按照设备操作常规进行。

1.6.6 TG、TC、BS、ALT、AST检测 按照设备、试剂操作常规进行。

1.7 统计学方法 本研究采用完全随机化设计,数据采用SPSS17.0版统计软件包进行统计学处理。计量资料用均数±标准差(±s)表示,组间比较及各组之间两两比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验过程中大鼠数量变化 模型组在T2DM并NAFLD造模过程中,死亡大鼠15只;在干预过程中, JH组、JL组、M组分别有1,2,3只大鼠死亡,实验结束JH组实有大鼠8只,JL组实有大鼠7只,M组实有大鼠6只。NM组实验过程中死亡1只,实有大鼠6只。N组大鼠饲养过程中无死亡。

2.2 MDA结果 M组、NM组、JH组、JL组上升,与N组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);JH组与M组比较差异有统计学意义(P＜0.01);JL组与M组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);JH组低于JL组,比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 SOD结果 M组、NM组、JH组、JL组下降,与N组比较,差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);JH组、JL组与M组比较,差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);JH组高于JL组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.4 肝组织TG浓度 NM组、JH组、JL组、M组肝组织TG上升,与N组比较,差异有统计学意义(P＜ 0.01);JH组、JL组低于M组,差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);JH组低于JL组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.5 ADP、ALT、AST结果 ADP结果:与N组比较, M组、NM组、JH组、JL组水平显著下降,差异有统计学意义(P＜0.01);JH组高于M组,差异有统计学意义(P＜0.01);JL组高于M组,差异有统计学意义(P＜0.05);JH组高于JL组,差异有统计学意义(P＜0.05)。ALT、AST结果:与N组比较,M组、NM组、JH组、JL组ALT、AST上升,差异有统计学意义(P＜0.01);JH组、JL组低于M组,差异有统计学意义(P＜0.01);JH组低于JL组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

2.6 BS、TG、TC结果 M组、NM组、JH组、JL组与N组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);JH组、JL组与M组比较,差异有统计学意义(P＜0.01)[9]。

3 讨论

本研究主要关注GPS是否通过抑制脂质过氧化达到抑制脂肪肝效果。研究通过与M组、N组、NAFLD组对比,观察GPS大剂量、小剂量对模型大鼠MDA、SOD、APN、ALT、AST变化,以肝组织TG沉积量观察脂肪肝程度,了解GPS抗脂质过氧化作用,以及对NASH抑制作用。

与N组比较,NAFLD组、JH组、JL组、M组肝组织脂质沉积量上升,JH组、JL组与M组比较显著下降,说明GPS具有抑制肝组织脂质沉积作用,具有抑制脂质过氧化的基础。

与N组比较,NAFLD组、JH组、JL组、M组肝组织MDA上升,JH组、JL组与M组比较显著下降。与N组比较,NM组、JH组、JL组、M组肝组织SOD、ADP下降,JH组、JL组与M组比较显著上升。

MDA是脂质过氧化产物,T2DM并NAFLD患者MDA升高[13];肝脏组织含有SOD等抗氧化酶,T2DM并NAFLD大鼠肝组织SOD含量显著下降[14];ADP是由脂肪细胞分泌的一种细胞因子,参与糖、脂代谢,具有改善胰岛素敏感性、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用[15]。说明T2DM并NAFLD大鼠脂质过氧化加重,抗脂质过氧化能力下降,胰岛素敏感性下降,炎症反应上升,“第二次打击”导致NAFLD程度加重。GPS通过抑制脂质过氧化达到降低“第二次打击”程度,抑制脂肪肝的目的,呈剂量依赖性。

表1 5组大鼠肝组织MDA、SOD、TG测定值Tab.1 Determ ination results of MDA、SOD、TG in liver tissue in five groups of rats ±s

表1 5组大鼠肝组织MDA、SOD、TG测定值Tab.1 Determ ination results of MDA、SOD、TG in liver tissue in five groups of rats ±s

与N组比较,*1P＜0.01,*4P＜0.05;与M组比较,*2P＜0.01,*3P＜0.05Compared with group N,*1P＜0.01,*4P＜0.05;compared with group M,*2P＜0.01,*3P＜0.05

组别大鼠/只MDA/(nmol·mL-1)SOD/(U·mL-1)TG/(mg·g-1) N组2.98±0.09 240.8±17.4 28.98±1.68 M组6 4.22±0.11*1149.9±20.6*1214.46±5.44*1NM组6 3.66±0.10*1*2181.6±19.4*1*3198.46±6.98*1*3JH组8 3.72±0.11*1*2209.8±19.2*2*4142.87±6.64*1*2JL组7 3.99±0.13*1*3189.4±18.9*1*3164.92±7.56*1*27

表2 5组大鼠血ADP、ALT、AST测定值Tab.2 Determ ination results of the plasma level of ADP,ALT and AST in five groups of rats ±s

表2 5组大鼠血ADP、ALT、AST测定值Tab.2 Determ ination results of the plasma level of ADP,ALT and AST in five groups of rats ±s

与N组比较,*1P＜0.01;与M组比较,*2P＜0.01,*3P＜0.05Compared with group N,*1P＜0.01;compared with group M,*2P＜0.01,*3P＜0.05

组别大鼠/只ADP/ (ng·m L-1) ALT AST (U·L-1) N组7.46±1.12 46.7±8.2 59.9±8.8 M组6 3.58±0.98*1 148.4±10.1*1 169.1±14.9*1NM组6 4.89±1.02*1*2 80.8±11.3*1*2 91.6±10.6*1*2JH组8 4.79±1.01*1*2 88.9±10.4*1*2 96.3±11.2*1*2JL组7 4.13±0.89*1*2 110.2±11.6*1*3 129.7±12.3*1*37

ALT、AST升高说明发生了NASH并导致肝损害,数据反映了肝细胞受损的程度。与N组比较,NM组、JH组、JL组、M组血清ALT、AST上升,JH组、JL组与M组比较显著下降。说明T2DM并NAFLD导致肝细胞损害,GPS具有减轻NASH、保护肝细胞作用。由于T2DM并NAFLD患者多存在肝功能障碍,而临床治疗糖尿病的常用药物,大多在肝脏进行代谢,长期应用可能会加重脂肪蓄积和肝功能损害[16]。从保护肝脏的角度,使用GPS有利于保护T2DM并NAFLD的肝功能。

现代药理研究证明,绞股蓝含有83种与人参皂苷有类似骨架的达玛烷型绞股蓝皂苷,皂苷具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫调节等多方面的生物活性和药理作用[17],NORBERG等[18]从绞股蓝中分离提纯出一种新的皂苷,存在4种可以相互转化的立体异构体,在体外及动物实验中均发现,其可刺激胰岛细胞释放胰岛素,且呈现剂量依赖性。XU等[19]对绞股蓝中分离得到的皂苷及其衍生物的降糖作用进行了研究,发现其可以通过抑制蛋白酪氨酸磷脂酶来控制胰岛素的敏感度。说明GPS通过刺激胰岛素分泌、提高胰岛素敏感性、调节血糖代谢、调节血脂代谢抑制“第一次打击”,通过抗纤维化[20]、抑制脂质过氧化、抗炎抑制“第二次打击”,多靶点抑制T2DM并NAFLD脂肪肝的进程。

[1] YOON K H,LEE JH,KIM JW,etal.Epidemic obesity and type 2 diabetes in Asia[J].Lancet,2006,368(9548): 1681-1688.

[2] 李勇杰,苏宏业,李圣琦.2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝检出率及临床特点[J].广西医学,2012,34(1):86-88.

[3] FARRELL G C,CHITTURIS,LAU G K,et al.Asia-Pacific Working Party on NAFLD.Guidelines for the assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease in the Asia-Pacific region:executive summary[J].JGastroenterol Hepatol,2007,22(6):775-777.

[4] BELLENTANI S,SCAGLIONI F,MARINO M,et al. Epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease[J].Dig Dis,2010,28(1):155-161.

[5] 谢杏榕,谭华炳,胡小林,等.不同程度非酒精性脂肪性肝病兔的血糖变化[J].中国老年学杂志,2011,31(2): 636-637.

[6] 谭华炳,李金科,胡波,等.非酒精性脂肪性肝病兔胰岛素水平变化及其机理探讨[J].西南国防医药,2010,20 (9):937-939.

[7] 谭华炳,贺琴.脂肪肝与血液流变学、C反应蛋白异常的关系[J].中国老年学杂志,2009,29(13):1662-1664.

[8] 葛均波,徐永健.内科学[M].8版.北京:人民卫生出版社,2013:408-411.

[9] 贺琴,雷飞飞,李儒贵,等.绞股蓝皂苷降低2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病大鼠血糖、血脂的机理研究[J].湖北医药学院学报,2013,32(1):39-43,封3.

[10] 闵怀臻,贺琴,李金科,等.绞股蓝皂苷对2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织NF-αmRNA表达和血硫化氢的影响[J].湖北医药学院学报,2013,32(4): 317-324.

[11] 谭华炳,雷飞飞,李敬会,等.绞股蓝皂苷对2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病大鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达影响[J].辽宁中医杂志,2013,40(8):1706-1708,封3.

[12] 王战建,张耀,宋庆芳,等.二甲双胍对高糖高脂饮食诱导的糖尿病大鼠脂肪肝治疗作用的研究[J].中国实用内科杂志,2006,26(20):1603-1605.

[13] 殷霞,成兴波.2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者血清铁蛋白水平与氧化应激、胰岛素抵抗的关系[J].江苏医药,2013,39(9):1072-1074.

[14] 彭继升,杨晋翔,高彦彬,等.降浊化瘀合剂对2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠的肝脏保护作用[J].中国中医基础医学杂志,2013,19(8):895-897,901.

[15] 孔银,张岭漪.瘦素及脂联素与非酒精性脂肪性肝病[J].临床肝胆病杂志,2011,27(4):441-443.

[16] 魏媛媛,闫冬,阿以仙木·加帕尔,等.石榴花多酚对糖尿病合并脂肪肝大鼠肝脏中PON表达的影响[J].药学学报,2013,48(1):71-76.

[17] 张娟,路金才.皂甙的提取方法及含量测定研究进展[J].中国现代中药,2006,8(3):25-28.

[18] NORBERG A,HOA N K,LIEPINSH E,et al.A novel insulin-releasing substance,phanoside,from the plantGynostemma pentaphyllum[J].J Biol Chem,2004,279 (40):41361-41367.

[19] XU JQ,SHEN Q,LIJ,etal.Dammaranes fromGynostemma pentaphyllumand synthesis of their derivatives as inhibitors of protein tyrosine phosphatase1B[J].Bioorg Med Chem, 2010,18(11):3934-3939.

[20] 赵世印,邱华,贺琴,等.绞股蓝皂苷对2型糖尿病并NAFLD大鼠肝纤维化影响[J].医药导报,2014,33(2): 156-159.

DOI 10.3870/yydb.2014.12.003

Effect of Gypenosides on Lipid Peroxidation in Rats with Type 2 Diabetes Mellitus Complicated by Nonalcoholic Fatty Liver Disease

HE Qin1,2,LI Fang1,TAN Hua-bing1
(1.Department of Infectious Disease,Laboratory of Liver Disease;2. Department of Pharmacy,Renmin Hospital,Hubei University ofMedicine,Shiyan 442000,China)

Objective To observe the effect of gypenoside on lipid peroxidation and hepatic lesion in rats with type 2 diabetesmellitus and nonalcohol fatty liver disease.MethodsTotally,65 SPFmale SD rats were randomly divided into blank control group(group N),NAFLD model group(group NM),and NAFLD with T2DM model group.The NAFLD with T2DM model group was further divided into three subgroups:JH group,perfused with 1 g·kg-1·d-1GPS;JL group,perfused with 0.5 g·kg-1·d-1GPS;model control group,perfused with the same volume ofwater.Blood sugar,triglycerides(TG),total cholesterol (TC),alanine aminotransferase(ALT),aspart aminotransferase(AST),adeponectin(ADP)in the plasma weremeasured.TG, malondialdehyde(MDA),and superoxide dismutase(SOD)in the liver tissue were also tested.ResultsADP level was (7.46±1.12),(3.58±0.98),(4.89±1.02),(4.79±1.01)and(4.13±0.89)ng·mL-1in N,M,NM,JH and JL groups, respectively.The ADP levelwas significantly higher in group JH and JL than in group M(P＜0.01),and significantly higher in group JH than in group JL(P＜0.05).MDA level was(2.98±0.09),(4.22±0.11),(3.66±0.10),(3.72±0.11),(3.99± 0.13)nmol·mL-1in N,M,NM,JH and JL groups,respectively.The MDA levelwas significantly lower in group JH and JL than in group M(P＜0.01),and significantly lower in group JH than in group JL(P＜0.05).SOD level was(240.8±17.4), (149.9±20.6),(181.6±19.4),(209.8±19.2),(189.4±18.9)U·mL-1in N,M,NM,JH,and JL groups,respectively.SOD level was significantly higher in group JH and JL than in group M(P＜0.01),and significantly higher in group JH than in group JL(P＜0.05).TG level was(28.98±1.68),(214.46±5.44),(198.46±6.98),(142.87±6.64)and(164.92±7.56) mg·g-1in N,M,NM,JH and JL groups,respectively.TG levelwas significantly lower in group JH and JL than in group M(P＜0.01),and significantly lower in group JH than in group JL(P＜0.05).ALT and AST were significantly lower in group JH and JL than in group M(P＜0.01),and significantly lower in group JH than in group JL(P＜0.05).ConclusionThe lipid peroxidation in the liver of rats with T2DM complicated with NAFLD can be reduced by gypenoside,and hepatic lesion may be alleviated through inhibition of lipid peroxidation.

Gypenosides;Diabetesmellitus,type 2;Liver disease,fatty,nonalcoholic;Lipid peroxidation;Hepatic lesion

R285.5;R587.1

A

1004-0781(2014)12-1549-05

2014-02-27

2014-05-19

*湖北省卫生厅2009年科研项目(JX4B59)

贺琴(1964-),女,湖北房县人,副主任药师,从事中药临床教学科研工作。电话:(0)15971892342,E-mail: renmthb@163.com。

谭华炳(1963-),男,湖北房县人,主任医师,教授,研究生导师,从事感染性疾病(肝病)临床教学科研工作。电话:(0)13707287512,E-mail:renm thb@163.com。