蛇床子素对脑缺血-再灌注损伤大鼠的保护作用*

赵永明,王金,石红,刘红彬,郑丽卿,董晓华

(1.河北北方学院药学系,张家口 075000;2.浙江九旭药业有限公司,金华 321016)

蛇床子素对脑缺血-再灌注损伤大鼠的保护作用*

赵永明1,王金1,石红2,刘红彬1,郑丽卿1,董晓华1

(1.河北北方学院药学系,张家口 075000;2.浙江九旭药业有限公司,金华 321016)

目的 观察蛇床子素对脑缺血-再灌注损伤大鼠的保护作用。方法采用线栓法制备局灶性脑缺血-再灌注模型,在脑缺血2 h再灌注24 h后,对大鼠神经功能进行评分,并测定脑梗死体积;同时测定脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)及线粒体中ATP酶的含量。结果与模型对照组比较,蛇床子素能降低脑梗死体积、改善脑缺血-再灌注大鼠神经功能,升高SOD活性、增加GSH含量,同时降低MDA含量。结论蛇床子素对大鼠脑缺血-再灌注损伤有保护作用。

蛇床子素;缺血-再灌注,脑;自由基

缺血性脑血管疾病是神经系统的常见疾病,由于发病率高、容易致残而严重影响公众健康,探索有效的预防与治疗措施具有积极的社会意义。蛇床子素(Osthole),化学名为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素,分子式C15H16O3,是伞形科植物蛇床子中提取得到的一种香豆素类单体。目前研究证实蛇床子素具有改善学习记忆[1-2]、清除自由基[3]、抑制血细胞聚集和血栓形成[4]等作用。本实验制备与临床发病情况相似的大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型,进一步研究蛇床子素对局灶性脑缺血-再灌注损伤大鼠的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley, SD)大鼠72只,体质量260～290 g,北京大学医学部实验动物中心提供(动物生产许可证号:SCXK(京) 2006-0008)。动物饲养于SPF级动物房中。

1.2 药物及试剂 蛇床子素(西安开来生物工程有限公司,纯度＞98%),尼莫地平(拜耳医药保健有限公司,批号:122514);氯代三苯基四氮唑(TTC,天津巴斯夫化工有限公司,分析纯);丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)试剂盒均购自碧云天生物技术研究所,Na+-K+-ATP ase、Ca2+-Mg2+-ATP ase试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 分组与模型构建 大鼠随机分为6组,即假手术组、模型对照组、蛇床子素小、中、大剂量组(4,8, 16 mg·kg-1)和尼莫地平组(4 mg·kg-1),每组12只。缺血后1 h分别腹腔注射蛇床子素和尼莫地平, qd,连续给药14 d,假手术组和模型对照组腹腔注射等体积的溶剂。给药剂量参照文献报道[5-6]。采用Longa法制备大鼠右侧大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion,MCAO)局灶性脑缺血-再灌注损伤模型[7]。在脑缺血2 h再灌注24 h后,每组取6只大鼠迅速断头处死,取脑,去除脑膜和血液,用磷酸盐缓冲溶液制备10%脑组织匀浆。部分匀浆液经1 000 r·min-1离心10 min后,取上清液继续12 000 r·min-1离心15 min,沉淀物加0.9%氯化钠溶液即为线粒体悬液。

1.4 神经功能行为评分 按Longa评分法,于缺血2 h、再灌注22 h对实验大鼠进行神经功能评分,标准如下:0分,无神经功能缺失;1分,轻微局灶性神经缺陷(左侧前爪不能完全伸直);2分,中度局灶性神经缺陷(向左侧旋转);3分,严重的局灶性神经缺陷(行走时向左侧倾斜);4分,不能行走[7]。

1.5 大鼠脑组织匀浆SOD、MDA、GSH的测定 分别取脑组织匀浆和线粒体悬液,其余操作严格按照试剂盒说明书进行,分别测定SOD、MDA和GSH含量。

1.6 线粒体组分ATP酶的测定 取线粒体悬液,按试剂盒操作说明测定Na+-K+-ATP ase,Ca2+-Mg2+-ATP ase活性。

1.7 脑梗死体积测定 在脑缺血2 h再灌注24 h后,迅速断头处死大鼠,取脑,用脑切片器间隔2 mm连续切片,共做冠状切片6个,置2%TTC溶液中,37℃水浴孵育30 min,然后用10%甲醛固定。染色后由于TTC被还原,最终正常脑组织呈红色,而缺血区呈白色;拍照后用计算机图像分析系统测定梗死面积,最后计算总梗死体积,以缺血损伤区占全脑体积的百分比评价脑损伤程度[8-9]。

2 结果

2.1 蛇床子素对脑缺血-再灌注损伤大鼠神经功能评分的影响 各组大鼠于MCAO术后,除假手术组外,其余各组大鼠均出现不同程度的神经运动功能障碍,主要表现为前肢肌张力降低、活动时步态不稳(向左侧倾倒或转圈)、提尾悬空时前肢内收等。蛇床子素小、中、大剂量组,尼莫地平组对缺血-再灌注损伤大鼠神经功能障碍均有改善作用,与模型对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表1。

2.2 蛇床子素对脑缺血-再灌注损伤大鼠线粒体组分ATP酶的影响 脑缺血-再灌注24 h,与假手术组比较,模型对照组大鼠线粒体中Na+-K+-ATP ase,Ca2+-Mg2+-ATP ase活性明显降低;而蛇床子素药物组和尼莫地平组Na+-K+-ATP ase,Ca2+-Mg2+-ATP ase活性则明显升高。见表2。

2.3 蛇床子素对脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织SOD、MDA、GSH的影响 与假手术组大鼠比较,模型对照组大鼠SOD活性明显降低,MDA含量明显升高,而GSH含量则显著降低。小、中、大剂量蛇床子素和尼莫地平可在一定程度上逆转上述作用,能升高SOD活性、增加GSH含量,同时降低MDA含量。见表3。

表1 6组大鼠神经功能评分比较Tab.1 Comparison of neurological scores among six groups of rats 分±s

表1 6组大鼠神经功能评分比较Tab.1 Comparison of neurological scores among six groups of rats 分±s

与模型对照组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

神经功能评分假手术组12…组别大鼠/只剂量/ (mg·kg-1) 0.00±0.00模型对照组12…3.48±0.57尼莫地平组12 4 1.93±0.46*1蛇床子素小剂量组12 4 2.75±0.39*2中剂量组12 8 1.62±0.34*1大剂量组12 16 1.33±0.28*1

表2 6组大鼠脑组织线粒体ATP酶活性比较Tab.2 Comparison of m itochondrial ATPase activity in brain among six groups of rats ±s

表2 6组大鼠脑组织线粒体ATP酶活性比较Tab.2 Comparison of m itochondrial ATPase activity in brain among six groups of rats ±s

与模型对照组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared withmodel control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

组别大鼠/只剂量/ (mg·kg-1) Na+-K+-ATP Ca2+-Mg2+-ATP (mmol·g-1·h-1)假手术组6…? 6.02±0.77 6.84±1.37模型对照组6…3.34±0.53 3.97±0.81尼莫地平组6 4 5.25±0.42*16.01±0.63*1蛇床子素小剂量组6 4 3.65±0.61 4.68±0.66中剂量组6 8 4.42±0.76*25.32±1.01*2大剂量组6 16 4.73±0.88*15.66±1.13*1

2.4 蛇床子素对脑缺血-再灌注损伤大鼠脑梗死体积的影响 脑缺血-再灌注24 h,发现除假手术组外,模型对照组、蛇床子素组和尼莫地平组大鼠脑组织均有不同程度梗死。与模型对照组比较,蛇床子素小剂量、中剂量、大剂量组和尼莫地平组脑梗死体积显著降低。见图1,表4。

3 讨论

脑缺血-再灌注时,毛细血管周围会产生大量自由基。自由基进一步攻击神经细胞膜,损伤血-脑脊液屏障,引发脂质过氧化,促进脑水肿形成,最终导致细胞膜功能缺失、线粒体受损或者神经元死亡[10]。MDA作为脂质过氧化的中间产物,能够反映体内自由基的数量及脂质过氧化程度;SOD的活性变化则表达机体清除自由基的能力。本实验观察到,大鼠脑缺血2 h,再灌注24 h后,与假手术组比较,模型对照组脑组织匀浆SOD活性、GSH含量明显降低,MDA含量明显升高;与模型对照组比较,药物组脑组织匀浆中SOD活性增强、MDA含量降低,表明蛇床子素对脑缺血-再灌注损伤时产生的自由基具有清除作用。

线粒体是细胞内的主要产能部位,当脑缺血缺氧发生时,线粒体功能降低,ATP量减少,使Na+-K+-ATP ase和Ca2+-Mg2+-ATP ase活性降低,最终细胞内Na+和Ca2+超载,进一步加重脑缺血-再灌注损伤[11]。本实验发现蛇床子素能抑制脑缺血-再灌注大鼠线粒体ATP ase活性降低,增强自由基清除能力,减少脂质过氧化物的生成,从而起到保护线粒体作用。

综上所述,蛇床子素对局灶性脑缺血-再灌注损伤大鼠有明显的线粒体保护作用和自由基清除作用,这可能是其保护缺血脑组织的作用机制之一。

表3 6组大鼠脑组织SOD、MDA、GSH水平比较Tab.3 Comparison of the content of SOD,MDA and GSH in brain among six groups of rats ±s

表3 6组大鼠脑组织SOD、MDA、GSH水平比较Tab.3 Comparison of the content of SOD,MDA and GSH in brain among six groups of rats ±s

与模型对照组比较,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

组别大鼠/只剂量/ (mg·kg-1) SOD/ (U·mg-1) MDA/ (μmol·g-1) GSH/ (mg·g-1)假手术组6…202.49±12.37 20.35±4.69 85.24±14.83模型对照组6…118.17±20.74 47.53±7.94 53.67±15.94尼莫地平组6 4 176.24±4.57*128.83±5.17*170.22±17.34*1蛇床子素小剂量组6 4 136.52±28.73*242.35±3.69 58.14±13.66中剂量组6 8 158.32±20.15*135.12±4.07*166.28±12.83*1大剂量组6 16 181.36±22.48*131.63±5.74*168.39±13.43*1

A.假手术组;B.模型对照组;C.尼莫地平组;D.蛇床子素小剂量组;E.蛇床子素中剂量组;F.蛇床子素大剂量组图1 6组大鼠脑组织TTC染色图A.sham group;B.model control group;C.nimodipine group;D.low-dose osthole group;E.medium-dose osthole group;F.high-dose osthole groupFig.1 TTC staining on brain of six groups of rats

表4 6组大鼠脑梗死体积比较Tab.4 Effect of osthole on the infarct volum e of six groups of rats ±s

表4 6组大鼠脑梗死体积比较Tab.4 Effect of osthole on the infarct volum e of six groups of rats ±s

与模型对照组比较,*1P＜0.01Compared withmodel control group,*1P＜0.01

组别大鼠/剂量/相对脑梗死只(mg·kg-1)体积/%假手术组6…0.00±0.00模型对照组6…35.34±4.52尼莫地平组6 4 12.66±1.94*1蛇床子素小剂量组6 4 27.33±3.89*1中剂量组6 8 22.15±3.76*1大剂量组6 16 16.78±3.46*1

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.005

Protective Effects of Osthole on Rats with Focal Cerebral Ischem ia-reperfusion Injury

ZHAO Yong-ming1,WANG Jin1,SHI Hong2,LIU Hong-bin1,ZHENG Li-qing1,DONG Xiao-hua1
(1. Department ofPharmacy,HebeiNorth University,Zhangjiakou 075000,China;2.Zhejiang Jiuxu Pharmaceutical Co.,Ltd,Jinhua 321016,China)

Objective To investigate the potential mechanism and protective effects of osthole on rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury.MethodsMiddle cerebral artery occlusion was induced by the suture-occluded method. After 2 h of cerebral ischemia and 24 h of reperfusion,scores ofneurological deficits and infarct volumewere evaluated.The levels of SOD,MDA,GSH and ATPase were also determined.ResultsScores of neurological deficits and infarct volume were lower in the osthole groups than in themodel group.Meanwhile,the activity of SOD and GSH content were increased,while the MDA contentwas decreased in osthole groups.ConclusionOsthole exerts protective effects on rats with focal cerebral ischemiareperfusion injury.

Osthole;Ischemia-reperfusion,brain;Free radical

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)12-1558-04

2013-11-26

2014-02-22

*河北省卫生厅资助项目(20110173, 20120155);河北省教育厅资助项目(Z2011304);河北省科技厅资助项目(13272704D)

赵永明(1978-),女,河南汝南人,讲师,硕士,从事中药新药开发研究。电话:0313-4029305,E-mail:zym2167 @163.com。