四氧化三铁/单壁碳纳米管磁性复合纳米粒子分散固相微萃取-高效液相色谱法测定牛奶中的香精添加剂

李海芳， 杨红云， 张 英， 王培龙， 林金明*

(1.清华大学化学系，北京100084;2.国家人造板与木竹制品质量监督检验中心，北京100091;3.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京100081)

磁性纳米颗粒作为一种新型的样品前处理萃取材料，因具有大的比表面积和外加磁场下的操控性，被越来越多地应用于样品前处理［1，2］。目前，通过修饰和包覆磁性纳米材料表面使其具有吸附特性是制备磁性萃取材料最常用的合成方法［3］。碳纳米管(carbon nanotubes，CNTs)由于其表面特殊的物理化学性质，具有很强的吸附性能，在样品前处理方面具有很好的应用前景［4，5］，近年来已被尝试用于环境污染物的富集［6，7］。合成的 CNTs水溶性差，也难溶于有机溶剂，在溶液中容易发生团聚，这些缺点使得CNTs直接用于样品前处理特别是液态基质样品受到很大的限制。为了克服这些缺点，将CNTs修饰在纳米或微米级的硅胶或磁性颗粒上，能够很好地增强CNTs的操控性和溶剂分散性［3，8，9］。本研究以具有良好顺磁性的 Fe3O4纳米颗粒为CNTs的固相载体，合成了复合性纳米粒子Fe3O4/CNTs，并用于微量、痕量组分的分散固相微萃取富集。

在奶制品加工过程中，为了提高香浓性，同时为了掩盖奶源由于供应季节性变化和地区不同的差异性，具有奶香味的香精常作为添加剂。香兰素与乙基香兰素具有香荚兰香气及浓郁的奶香，在食品工业中作为香精添加剂被广泛使用。对香兰素和乙基香兰素生物化学毒性的研究已有大量文献报道，超剂量的香兰素和乙基香兰素会损害身体健康［10］。根据国家标准GB2760-2011的规定，凡使用范围涵盖0至6个月婴幼儿的配方食品不得添加任何食用香料，较大婴儿和幼儿的配方食品中香兰素和乙基香兰素最大使用量为50 mg/L。监控婴幼儿配方食品特别是奶制品中香精添加剂的含量是非常必要的。由于奶制品的基质非常复杂，含有大量的蛋白质、脂肪、糖类、磷脂、维生素和无机盐等，进行微量目标物的测定常需要进行样品前处理［11］。关于牛奶中香兰素和乙基香兰素的富集与测定已有不少文献报道，包括中空纤维液相微萃取［12］、固相微萃取［13］、离子液体萃取［14］、分子印记［15］等样品前处理方法。

本文通过化学键合的方法制备了单壁碳纳米管包覆的Fe3O4/CNTs纳米粒子，将其用作分散固相微萃取剂快速富集牛奶中的香兰素和乙基香兰素，并采用高效液相色谱法进行定量分析。通过优化影响萃取效果的关键因素(包括洗脱溶剂、样品pH值、样品离子强度等)，发展了一种快速、高效的牛奶香精添加剂的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Hitachi L2000液相系统，配紫外检测器;傅里叶变换显微红外光谱仪(Nicolette 5DXB FT-IR)。

香兰素和乙基香兰素标准品，乙二醇、无水醋酸钠、氨丙基三乙基硅烷化试剂(3-aminopropyltriethoxysilane，APTES)和聚乙二醇均购自 Sigma-Aldrich公司。正己烷、二氯甲烷、苯、甲苯和甲醇购自J.T.Baker公司。1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)和 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)购自吉尔生化(上海)有限公司。FeCl3·6H2O、磷酸、浓硫酸和硝酸由北京试剂厂生产。单壁碳纳米管(直径1～2 nm，长度约20 μm，比表面积＞380 m2/g)购自中国科学院成都有机化学有限公司。

1.2 磁性复合纳米粒子Fe3O4/CNTs的制备

［16］的基础上，按照图1所示的基本原理制备磁性复合纳米粒子Fe3O4/CNTs。首先采用水热法制备Fe3O4磁性纳米颗粒，并采用APTES硅烷化试剂对Fe3O4颗粒表面进行氨基化修饰。同时，用强酸对单壁碳纳米管进行酸化处理使其表面带上羧基。最后，将羧基化的CNTs通过交联剂修饰到氨基化的Fe3O4磁性纳米颗粒表面。

1.2.1 磁性纳米材料Fe3O4的制备及表面氨基化

磁性纳米材料Fe3O4的制备采用水热还原法［17，18］。利用乙二醇将 FeCl3还原为 Fe3O4;加入静电稳定剂无水醋酸钠和表面活性剂聚乙二醇，防止颗粒团聚。具体反应条件为:称取1.35 g FeCl3·6H2O溶于40 mL乙二醇中，磁力搅拌下加入3.6 g无水醋酸钠和1.0 g聚乙二醇，在60℃下剧烈搅拌至完全溶解，然后将混合溶液转入50 mL的反应釜中，在200℃下反应12 h，然后冷却至室温。对合成的Fe3O4纳米颗粒用水与无水乙醇交替清洗，在80℃下真空烘干备用。

称取150 mg Fe3O4纳米颗粒于乙醇中超声分散，然后转至250 mL三口烧瓶中，搅拌升温至60℃，再缓慢匀速滴加300 μL的 APTES，升温至80℃，冷凝回流反应6 h。过滤收集固体反应产物，用无水乙醇与去离子水反复洗涤后，得到Fe3O4-NH2磁性纳米颗粒。

图1 Fe3O4/CNTs磁性纳米颗粒的制备Fig.1 Preparation of Fe3O4/CNTs

1.2.2 CNTs的表面羧基化

称取CNTs 100 mg加入装有H2SO4/HNO3(3∶1，v/v)混合酸的50 mL离心管中，于60℃下超声8 h，冷却后倒入冰水中，于10 000 r/min下离心分离10 min，收集下层的CNTs-COOH产物并反复用蒸馏水洗涤至中性，于80℃真空干燥箱中烘干备用。

1.2.3 Fe3O4/CNTs材料的制备

取130 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.0)，置于500 mL三口烧瓶中，加入50 mg的 CNTs-COOH，充分搅拌(500 r/min)。准确称取50 mg EDC、100 mg NHS分别溶解于10 mL磷酸缓冲溶液(pH 7.0)中，然后将二者加入到三口烧瓶中剧烈搅拌(500 r/min)30 min，使CNTs-COOH充分活化。最后加入200 mg的Fe3O4-NH2磁性纳米颗粒，充分反应2 h后终止反应。将最终反应物Fe3O4/CNTs用蒸馏水和无水乙醇反复清洗，将其放入80℃真空干燥箱中烘干备用。

1.3 液相色谱定量分析

采用外标曲线法定量。分别配制1 000 mg/L香兰素和乙基香兰素标准品的甲醇储备液，采用逐级稀释的方法配制浓度梯度为 200、100、50、5、0.1、0.01 mg/L的系列标准溶液，做外标曲线。考察检出限、定量限和相对标准偏差(RSD)。

色谱分离采用Lichrospher ODS-BP色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱温为 40 ℃，进样体积为10 μL，流动相为甲醇/水(60/40，v/v)，流速为 0.8 mL/min，紫外检测波长为293 nm。

1.4 基于Fe3O4/CNTs的分散固相微萃取

1.4.1 牛奶样品的预处理

称取牛奶约10 mL，加入20 mL乙腈，加入0.01 mol/L NaOH 调节 pH 为 11.0，超声 5 min，于10 000 r/min离心15 min;移取样品上清液，在其中加入0.01 mol/L HCl调节 pH 至3.0，用 0.45 μm滤膜过滤，用水定容至100 mL。

1.4.2 牛奶样品的Fe3O4/CNTs分散固相微萃取

称取10 mg的Fe3O4/CNTs磁性纳米颗粒置于5.0 mL离心管中，依次采用正己烷、丙酮、甲醇和去离子水清洗和活化;然后加入预处理后的牛奶样品2 mL，超声5 min;用磁铁将Fe3O4/CNTs颗粒分离收集在离心管底部，弃去样品废液。加入0.1 mL去离子水洗涤Fe3O4/CNTs，然后加入1.5 mL甲醇洗脱富集在Fe3O4/CNTs的目标物，洗脱液用氮气浓缩，再用移液器加入200 μL甲醇重新溶解，待HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4/CNTs的表征与性能评价

分别采用透射电镜、傅里叶红外光谱仪等对制备的Fe3O4/CNTs磁性纳米颗粒的物相、粒度、表面功能团进行了表征。

2.1.1 红外光谱表征

图2 CNTs和Fe3O4纳米颗粒修饰前后的红外光谱谱图Fig.2 FTIRspectra of CNTs and Fe3O4nanoparticles before and after modificationa.FTIR spectra of Fe3O4nanoparticles before and after amino silanization modification;b.comparison of FTIR spectra of CNTs，CNTs-COOH and Fe3O4/CNTs.

采用KBr压片的方法，对各步骤的合成产物进行红外光谱表征。图2a为Fe3O4纳米颗粒APTES硅烷修饰前后的谱图对比。水热法合成的Fe3O4在579 cm－1处有Fe－O －Fe键的伸缩振动峰，是Fe3O4的特征吸收峰;在3 409 cm－1处的吸收峰是－OH的伸缩振动峰，对应的弯曲振动峰在1 623 cm－1处，表明在Fe3O4纳米颗粒表面存在 －OH。经APTES修饰后，出现1 105 cm－1处的Si－O 键特征吸收峰，2 921 cm－1处－CH2的C－H伸缩振动峰。1 623 cm－1和3 423 cm－1处的加强峰推断为Fe3O4颗粒表面－NH2的特征峰以及残余的－OH峰。这些吸收峰表明Fe3O4纳米颗粒表面修饰上了硅烷化氨基。图2b是 CNTs、羧基化 CNTs和Fe3O4/CNTs的红外光谱对比。可以看出，经过强酸处理后的CNTs在1 700 cm－1处具有非常明显的羧基官能团吸收峰，同时在3 435 cm－1处存在很明显的 －OH峰，表明碳纳米管表面修饰上了 －COOH。在 Fe3O4/CNTs的红外谱图中，1 720 cm－1处为 C=O 的伸缩振动峰，3 440 cm－1、1 530 cm－1与 1 210 cm－1处为仲酰胺的特征峰，表明CNTs成功接枝在磁性颗粒Fe3O4的表面。

2.1.2 纳米颗粒的粒度与分散性

用透射电镜(TEM)表征制备的纳米颗粒的粒度和形貌。如图3a所示，通过水热法合成的Fe3O4磁性碳纳米颗粒为规则的球形，且颗粒均匀，分散性好。粒径基本在200～300 nm范围内。在这个范围内的磁性纳米颗粒，具有很高的比表面积及很强的磁性。图3b为CNTs包覆后的Fe3O4颗粒的TEM图，可以看出CNTs包覆层的结构是比较松散的。如图3c所示，经超声分散后，Fe3O4/CNTs颗粒在无水乙醇中具有很好的分散性，且在外加磁场作用下，Fe3O4/CNTs颗粒能够迅速从溶液中被分离收集。

图3 制备的Fe3O4/CNTs纳米颗粒的形貌与分散性Fig.3 Characterization of feature and dispersivity of the prepared nanoparticlesa，b.TEM images of prepared Fe3O4and Fe3O4/CNTs;c.dispersive Fe3O4/CNTs in ethanol reagent(left)and with external magnet(right).

2.2 Fe3O4/CNTs分散固相微萃取条件的优化

以Fe3O4/CNTs为固相萃取材料富集香兰素和乙基香兰素，考察了吸附容量、洗脱溶剂、样品溶液的pH值及离子强度、萃取时间等因素对富集效果的影响。

2.2.1 吸附容量的测定

吸附容量是衡量吸附剂萃取能力的主要指标。本实验采用50 mg/L的香兰素与乙基香兰素混合标准溶液，通过改变加入标准溶液的体积监测Fe3O4/CNTs固相萃取材料的吸附容量。实验结果表明，10 mg的Fe3O4/CNTs固相萃取材料的吸附饱和量为250 μg，吸附容量为25 mg/g。

2.2.2 洗脱溶剂的选择

比较了正己烷、二氯甲烷、苯、甲苯、甲醇等溶剂对富集在Fe3O4/CNTs上的香兰素和乙基香兰素的洗脱效果，发现甲醇对香兰素和乙基香兰素具有更高的洗脱效率。因此选择甲醇为洗脱溶剂。

2.2.3 样品溶液pH值的影响

样品溶液的pH值是影响被分析物在样品介质与萃取溶剂之间分配系数的一个重要因素。如图4所示，考察pH在1.0～13.0范围内香兰素和乙基香兰的萃取效率，发现萃取效率随着溶液pH值的升高而降低。特别是在碱性条件下，萃取效率急速下降。原因是香兰素与乙基香兰素均含有酚羟基，在碱性条件下，二者会以酚盐的形式溶解在水溶液中，不利于萃取。虽然pH 1.0时的萃取效率比pH 3.0时略高，但过低的pH值会影响Fe3O4/CNTs材料的稳定性，最终选择样品溶液的最佳pH值为3.0。

图4 样品溶液的pH对萃取效率的影响Fig.4 Effect of the pH value of the sample solution on the extraction efficiencyExtraction conditions:sample，1 mg/L of vanillin and ethyl vanillin with 10%(m/m)NaCl added;extraction time，5 min.

2.2.4 样品溶液离子强度的影响

在固相萃取过程中，样品溶液的离子强度是影响萃取效率的重要因素之一。通过向样品溶液中加入盐来增加离子强度，可以减小待测物质在水溶液中的溶解度，提高萃取效率。根据盐析效应，向溶液中加入NaCl会降低香兰素和乙基香兰素在水相中的溶解度，有助于提高二者的萃取效率。实验考察了NaCl含量为0～25%(质量分数)时对香兰素和乙基香兰素萃取效率的影响。在NaCl含量为10%时萃取效率达到最大值;继续增大NaCl含量，萃取效率反而略有减弱，这是因为随着盐浓度的继续增加溶液的黏度会加大，使分析物的扩散速率降低，在固定的萃取时间内不能达到萃取平衡，导致萃取效率降低。故选择在样品溶液中添加10%的NaCl。

2.2.5 萃取时间的影响

萃取时间是固相萃取技术的重要参数之一。当吸附剂与目标物之间未达到吸附平衡时，随着萃取时间的增加，萃取效率通常会增加。同时，在保证富集效果的前提下，应该尽量缩短萃取时间。考察了1～7 min的萃取时间对香兰素和乙基香兰素萃取效率的影响。如图5所示，萃取富集5 min时香兰素和乙基香兰素的萃取效率达到最大值。

图5 萃取时间对萃取效率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the extraction efficiencyExtraction conditions:the standard solution containing 1 mg/L of vanillin and ethyl vanillin as the model by adjusting pH value to 3.0 and adding 10%NaCl.

2.3 富集效果与分析方法的性能评价

在最优化的条件下，考察了香兰素与乙基香兰素在0.1～100 mg/L范围内的线性相关性、检出限、定量限以及峰面积的重复性(RSD)。如表1所示，使用Fe3O4/CNTs分散固相微萃取与高效液相色谱分析联用的方法，检测具有较高的灵敏度，对香兰素和乙基香兰素的检出限达到10 μg/L，完全能够满足牛奶中香兰素和乙基香兰素的检测。对质量浓度为5 mg/L的标准溶液进行连续6次的萃取与色谱分析，香兰素和乙基香兰素的RSD分别为4.9%和5.1%，表明方法具有较好的重现性。

表1 固相微萃取方法的线性范围、相关系数、检出限、定量限和重复性Table 1 Linear ranges，correlation coefficients(R2)，limits of detection(LODs)，limits of quantification(LOQs)of the SPME method

2.4 实际样品检测

分别对不同类型的奶制品包括牛奶、酸牛奶、婴儿配方奶粉进行检测。图6是对牛奶样品的检测谱图，香兰素和乙基香兰素均被检出，含量分别为(11.6±0.6)mg/L和(10.3±0.5)mg/L。如表2所示，在酸奶中也同时检测到了香兰素和乙基香兰素添加剂，在婴儿奶粉中只检测到香兰素添加剂。令人欣慰的是所有样品中的香兰素和乙基香兰素添加剂均未超过国家规定的限量值。

向实际样品中分别添加1 mg/L的香兰素和乙基香兰素标准品，在最优化的萃取和色谱分析条件下进行回收率测定。对于不同类型的实际加标样品，香兰素和乙基香兰素的回收率均大于92%，表明Fe3O4/CNTs萃取和色谱分析方法具有很高的准确度和适用性。

图6 (a)牛奶样品和(b)加标(1.0 mg/L香兰素和乙基香兰素)牛奶样品的色谱图Fig.6 Chromatograms of(a)a real milk sample and(b)the real milk sample spiked with 1.0 mg/L vanillin and ethyl vanillinPeak identifications:1.vanillin;2.ethyl vanillin.

表2 不同奶制品中香兰素和乙基香兰素的含量Table 2 Contents of vanillin and ethyl vanillin in different milk products

3 结论

本研究建立了磁性纳米Fe3O4/CNTs分散固相微萃取与高效液相色谱联用快速检测香兰素和乙基香兰素的方法。在酸性介质条件下，合成的Fe3O4/CNTs固相萃取剂对奶类制品中的香兰素和乙基香兰素具有较好的萃取效果和较高的回收率，其检出限达10 μg/L。另外，结合不同的样品预处理技术，该方法还可推广应用到其它类型食品中香兰素和乙基香兰素添加剂的检测。

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