新疆地区冠心病秽浊痰阻证动物模型的实验研究*

2014-05-07 11:52王昕宇安冬青
中国中医急症 2014年4期
关键词:造模空白对照批号

王昕宇 杨 剑 安冬青△

(1.新疆医科大学中医学院,新疆 乌鲁木齐 830011;2.新疆医科大学附属中医医院,新疆 乌鲁木齐 830011)

新疆地区冠心病秽浊痰阻证动物模型的实验研究*

王昕宇1杨 剑2安冬青1△

(1.新疆医科大学中医学院,新疆 乌鲁木齐 830011;2.新疆医科大学附属中医医院,新疆 乌鲁木齐 830011)

目的通过人工气候箱结合喂养高脂饲料并腹腔注射维生素D3,建立新疆地区冠心病秽浊痰阻证大鼠模型。通过组织切片、血清指标,摸索模型建立条件。方法按RCT原则,将20只SD大鼠分为空白对照组、秽浊痰阻证模型组,每组10只。空白对照组正常饮水喂基础饲料;秽浊痰阻证模型组正常饮水喂高脂饲料并腹腔注射维生素D3,同时每日固定11 h在人工气候箱寒燥条件下饲养。实验第13周,行大鼠主动脉瓣至髂肾动脉分支处动脉及肝脏组织切片检查;测体质量、血清总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇、血清白细胞介素6、肿瘤坏死因子-α。结果两组大鼠体质量、血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇、IL-6、TNF-α差异均有统计学意义(P<0.05),而三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇差异无统计学意义(P>0.05);动脉血管壁内膜下见无定形物质沉积,有泡沫样细胞;肝组织外周出现中度肝脂肪变性。结论冠心病秽浊痰阻证大鼠模型,基本表现出新疆地区冠心病秽浊痰阻证辨证要点,初步推测造模方法具有一定可行性。

冠心病秽浊痰阻证大鼠模型 血脂 组织切片 白细胞介素6 肿瘤坏死因子α

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型。胸痹心痛根据其临床证状特点,类似于现代医学之冠心病[1]。本课题组对新疆医科大学附属中医医院心血管专科就诊的2215例确诊为冠心病的患者的辨证分型及常见症状的发生频度分析,发现新疆地区胸痹以五脏虚损、秽浊痰湿阻于脉络形成血瘀,气虚、秽浊痰湿、瘀血交织最为多见,即秽浊痰阻气虚血瘀证是新疆地区胸痹的主要证型[2];诱发因素包括年龄、脂质代谢异常、高血压、肥胖、饮食、寒冷、干旱少雨、沙尘风暴、沙尘花粉等[3-4]。本课题组将诱发冠心病的危险因素与新疆地区冠心病秽浊痰阻证的证候结合,尝试建立“病证结合”的动物模型,以探讨冠心病的病理、生理变化与中医证候特征之间的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD大鼠20只,雄性,体质量(160± 20)g,新疆医科大学实验动物中心提供(通过北京动物管理委员会评估认证)。饲养条件:标准饲料,温度(22±2)℃,相对湿度40%~70%,通风光照良好。

1.2 药物与试剂 药物:胆固醇(北京化学试剂公司,批号010927)、去氧胆酸钠 (广东环凯微生物科技公司,批号200701023)、丙基硫氧嘧啶(深圳市中联制药有限公司,批号0610312)、维生素D3(上海第九制药厂,批号980802)。试剂:血清总胆固醇(T-CHO)试剂盒(货号A030,批号200804011)、三酰甘油(TG)试剂盒(货号A035,批号200704032)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒(货号A027,批号200706120)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒(货号A028,批号200804091)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)试剂盒(货号A029,批号200803225)、大鼠血清白细胞介素6(IL-6)试剂盒(批号201011215)、大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(批号201007421),均购自长春汇力生物技术有限公司;10%甲醛固定液,10%乌拉坦溶液等。

1.3 仪器 MIC400人工气候箱 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、台式天平、C390高速低温离心机(Sigma公司)、分离胶采血管、OLYMPUS-AU5421型全自动生化分析仪 (日本O-LYMPUS公司)、OLYMPUS BH-2荧光显微镜 (日本OLYM-PUS公司)、LEICA RM2135型切片机(德国LEICA公司)、酶标仪。

1.4 分组及给药 分组:按RCT原则,将20只SD雄性大鼠分为空白对照组、秽浊痰阻证模型组,每组10只。高脂饲料制备:71.3%的标准基础饲料中,加入3%胆固醇、0.5%去氧胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、20%猪油(将各物人工充分混匀,再经加热溶化的猪油搅拌,压成圆条状饲料备用)[5-8]。模型制备:造模共12周。适应性饲养7 d,随后开始正式实验。在喂食高脂饲料第1周第1日,第1次腹腔注射维生素D360万IU/kg;第5周第1日,第2次腹腔注射维生素D360万IU/kg;第9周第1日,第3次腹腔注射维生素D360万IU/kg;空白对照组相同时间,3次腹腔注射同等单位0.9%氯化钠注射液[5-8]。同时,秽浊痰阻证模型组大鼠,每日9∶00~20∶00,放入人工气候箱。人工气候箱系统设定为(6±2)℃,相对湿度25%~32.8%[9-10]。以模拟新疆地区环境。

1.5 动物处理及指标检测 实验第13周第1日,处死19只大鼠(模型组1只大鼠实验中途死亡),行大鼠主动脉瓣至髂肾动脉分支处动脉及肝脏组织病理切片检查;检测体质量、血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL-C、IL-6、TNF-α。

1.6 主动脉瓣至髂肾动脉分支处动脉、肝脏组织切片检查 实验第13周,两组大鼠禁食不禁水12 h,用10%乌拉坦溶液(0.01 mL/kg)麻醉,沿主动脉瓣至髂肾动脉分支处剥离动脉,纵向剪开,在10%甲醛溶液中固定3 d;将新鲜采集的肝脏组织置10%甲醛溶液固定3 d。两部分标本行脱水、二甲苯透明、三步石蜡法制病理切片,光镜观察截取图片。

1.7 血脂、IL-6、TNF-α检测 实验第13周,将两组大鼠禁食不禁水12 h,用10%乌拉坦溶液 (0.01 mL/kg)麻醉,用分离胶心脏采血管采血5 mL,高速低温离心机3500 r/min离心10 min,2~8℃静置。行TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL-C检测;IL-6、TNF-α(ELISA)检测。

1.8 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以(±s)表示,正态性、方差齐用单因素方差分析LSD检验,方差不齐用单因素方差分析的Dunnett’s T3检验。非正态性资料用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学指征评价及死亡情况 空白对照组大鼠精神状态良好,毛色较白有光泽,目睛光亮有神,反应灵敏,饲喂时有较大反应,不断抓挠食盒,舌质暗红,舌无苔,大便干结成颗粒状。秽浊痰阻证模型组大鼠从3周左右开始发现精神欠佳,目光呆滞,活动少,饮食减少;7周左右饲喂时较少有反应,喜卧少动,饮食有所减少,毛色变暗;10周左右发现目睛混浊,饮食略有增加。舌质暗紫有瘀斑,舌苔薄腻、大便黏滞不成形。秽浊痰阻证模型组4号大鼠,因厌食、逐渐消瘦致体质较差,于实验第5周死亡,未行尸检。造模成功率95%。

2.2 两组大鼠体质量比较 造模后空白组大鼠平均体质量为(336.0800±31.5062)g,秽浊痰阻证模型组大鼠平均体质量为(225.1111±34.6751)g,秽浊痰阻证模型组大鼠体质量较造模前明显增高,但较之空白对照组,体质量偏低(P<0.05)。

2.3 两组大鼠血脂指标及IL-6、TNF-α比较 见表1,表2。结果示T-CHO、LDL-C、VLDL-L、IL-6、TNF-α差异均有统计学意义(P<0.05),而TG、HDL-C差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 两组大鼠造模后血脂指标比较(mmol/L,±s)

表1 两组大鼠造模后血脂指标比较(mmol/L,±s)

与秽浊痰阻证模型组比较,*P<0.05。下同。

组 别 TG HDL-C空白对照组 1.2800±0.33807 1.3160±0.19283秽浊痰阻证模型组 2.4433±1.18128 1.4600±0.63370 n TC 10 2.0620±0.24912*9 16.1422±9.10956

表2 两组大鼠造模后血脂、血清指标比较(mmol/L,±s)

表2 两组大鼠造模后血脂、血清指标比较(mmol/L,±s)

组 别n IL-6(pg/mL)TNF-α(ng/mL)空白对照组 127.94±32.80* 182.42±17.45*秽浊痰阻证模型组 484.31±171.26 407.71±99.73 10 9 LDL-C(mmol/L)VLDL-C(mmol/L)0.2030±0.03335* 0.5430±0.08433*6.6867±4.19984 7.9956±4.50373

2.4 主动脉瓣至髂肾动脉分支处动脉、肝脏组织切片检查 主动脉具有早期动脉粥样硬化(AS)斑块病理倾向,以动脉分叉开口处较多,说明血流动力学在AS的进程中起一定作用,在动脉分叉开口处血流方向改变,涡流增加,对动脉内膜冲击损伤作用增强,促进AS病变形成。

2.5 组织切片比较 组织切片显示秽浊痰阻证模型组大鼠动脉及肝脏组织均不同程度地出现AS早期病理表现,即动脉以内膜下层泡沫细胞出现、无定形物质沉积为主要表现。

图1 主动脉瓣至髂肾动脉分支处选取的动脉组织切片比较(×400)

图2 肝脏组织切片比较(×200)

2.6 主动脉内膜厚度、泡沫细胞比较 见表3。结果示两组差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 两组大鼠主动脉内膜厚度、泡沫细胞比较(±s)

表3 两组大鼠主动脉内膜厚度、泡沫细胞比较(±s)

组 别 泡沫细胞(%)空白对照组 3.64±0.54*秽浊痰阻证模型组 35.87±5.71 n 内膜厚度(μm)10 11.84±3.68*9 48.41±14.61

3 讨论

秽浊痰阻证模型组大鼠TC、LDL-C、VLDL-C均显著增高,均是诱发AS病变的危险因素。体质量方面,秽浊痰阻证模型组大鼠体质量增长缓慢,一方面与高脂饲料诱发脂质代谢失常密切相关,导致实验动物食欲下降;另一方有文献显示,高脂饲料结合维生素D3的造模方法在实验第10周时,体质量会逐渐恢复增长趋势[11]。人工气候箱的寒燥环境易伤脾胃,使水谷运化失常、久化痰浊、浊气不降、清气不升,导致大鼠出现嗜睡懒动、反应迟缓、活动能力差、大便黏滞不成形等一系列表现。燥邪侵扰,痰湿凝结于血脉,导致大鼠舌质暗红或暗紫、苔腻。秽浊痰阻证大鼠模型基本表现出新疆冠心病秽浊痰阻证辨证要点。组织切片方面,秽浊痰阻证模型组大鼠动脉及肝脏组织均不同程度出现AS早期病理表现,即动脉以内膜下层泡沫细胞出现、无定形物质沉积为主要表现。大鼠TG、HDL-C均无明显改变,可能与造模时间不足及鼠龄有关。

由于大鼠无胆囊,对胆固醇等脂质吸收少,单纯喂食高脂饲料很难诱导大鼠AS的形成,为保证秽浊痰阻证动物模型的成功建立,在人工气候箱寒燥环境下,饲料中添加了去氧胆酸钠,以显著增加大鼠小肠对胆固醇的吸收量。同时添加丙基硫氧嘧啶,抑制甲状腺功能、减少大鼠对胆固醇的代谢,以确保血清总胆固醇含量的升高。高糖是另一个诱导AS的因素,在饲料中添加糖粉,不仅能促进血糖升高,且糖分的粘合作用,使高脂饲料易于压制成颗粒,便于大鼠的食用。维生素D能显著促进AS的发生,经腹腔注射维生素D3后,血钙浓度出现显著升高,破坏动脉管壁内皮的完整性[12]。

本实验利用人工气候箱,模拟新疆地区特殊的寒燥气候,结合高脂饲料维生素D3混合喂养大鼠,以多样化致病因素的重叠干预,反映了秽浊痰阻证的证候临床特点,初步探索地新疆冠心病秽浊痰阻证“病证结合”动物模型的建立条件,为课题组系列研究奠定了科学基础。

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Study on Animal Model of Xinjiang Coronary Heart Disease with Phlegm-turbidity Syndrome

WANG Xin-yu,YANG Jian,AN Dong-qing. TCM College of Xinjiang Medical University,Xinjiang,Wulumuqi 830011,China

Objective:To establish animal model of Xinjiang coronary heart disease with phlegm-turbidity syndrome by combined treatment of artificial climate chamber,high-fat diet,abdominal injection of vitamin D3,and to explore animal model conditions by biopsy and serum index.M ethods:By RCT principle,20 SD rats were divided into normal control group and phlegm-turbidity syndrome group,10 rats in each group.Normal control group was fed the basis diet;phlegm-turbidity syndrome group was fed the high-fat diet,injected with vitamin D3,and fixed 11 hours a day in the artificial climate chamber of cold dry conditions.13 weeks later,tissue sections of aortic renal artery branch to iliac artery and liver were checked.Then weight,total cholesterol in serum,triglycerides,high-density lipoprotein cholesterol,low-density lipoprotein cholesterol,extremely low density lipoprotein cholesterol,interleukin-6in serum,and tumor necrosis factor-α were measured.Result:Compared with normal control group,body weight,total cholesterol in serum,low-density lipoprotein cholesterol,extremely low density lipoprotein cholesterol,serum interleukin-6,and tumor necrosis factor-α in model group had statistical differences (P<0.05).In aspects of triglycerides and high-density lipoprotein cholesterol,there were no significant differences(P>0.05).There were amorphous materials deposited under artery wall intima.Foam-like cells and moderate hepatic steatosis in liver tissue periphery were observed.Conclusions:Animal model demonstrates the basic clinical characters of Xinjiang coronary heart disease with phlegm-turbidity syndrome so modeling method is initially speculated of certain feasibility.

Animal model of coronary heart disease with phlegm-turbidity syndrome;Lipids;Tissue sections;IL-6;TNF-α

△通信作者

R285.5

A

1004-745X(2014)04-0585-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.009

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2010211A24);新疆名医名方与特色方剂学实验室开放课题(XJDX0910-2009-04)

2013-12-25)

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