文蛤坎氏弧菌的分离鉴定

王雪鹏 （山东农业大学动物科技学院 泰安 271018）柴雪良 闫茂仓 （浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室 温州）

文蛤坎氏弧菌的分离鉴定

王雪鹏 （山东农业大学动物科技学院 泰安 271018）柴雪良 闫茂仓*（浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室 温州）

本文从江苏文蛤养殖区发病文蛤中分离到1株优势菌，人工感染显示菌株能引起供试文蛤发病，死亡率为68.75%，且发病症状与原发病症状相同，提示该菌是引起文蛤大面积死亡的主要致病菌。对其形态、生理生化特征致病性进行了初步研究。结果显示分离菌株为革兰氏阴性菌，直杆状，主要生理生化指标赖氨酸脱羧酶、硝酸盐还原、甘露糖、氧化酶为阳性，精氨酸脱羧酶、鸟氨酸酸脱羧酶、V.P为阴性。结合革兰氏染色、形态、生理生化特点，最后鉴定该分离菌株为坎氏弧菌。

文蛤 坎氏弧菌 16S rRNA

文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)是我国沿海常见的一种重要经济贝类，因其肉质细嫩、营养丰富，深受国内外消费者欢迎，是出口创汇的重要水产品之一。文蛤养殖在我国已有多年的历史，随着国际市场对文蛤需求量的不断增长，我国的文蛤养殖业得到了迅速发展，但是近10几年来，随着文蛤养殖规模的逐年扩大，养殖环境恶化导致微生物疾病的流行而引发的养殖文蛤的大规模死亡屡屡发生，已造成巨大的经济损失，全国养殖贝类因微生物疾病导致死亡而造成的经济损失保守估计每年达到20～30亿元[1]。而弧菌(Vibrio)是导致文蛤发病的主要致病菌，发病的文蛤表现为不能潜入沙中，双壳不能紧闭，壳边缘有许多粘液，消化道内细菌大量繁殖[2]，国内外的报道有副溶血弧菌[3-6]和弗氏弧菌[7]，郑国兴等[8]发现导致江苏沿岸文蛤大规模死亡的病原菌为溶藻弧菌，而坎氏弧菌作为文蛤病原菌的研究还未见报道。本研究对发病文蛤优势菌株进行分离、鉴定，并进行人工感染试验，探讨分析导致文蛤大规模死亡的病原，旨在为文蛤疾病研究提供理论依据，为文蛤健康养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 发病文蛤症状 患病文蛤(壳长2cm左右)花色暗淡无光泽，表皮部分脱落、表面粘液较少，解剖发现外套膜萎缩，闭壳肌松弛、开合无力，有些发烂发白，软体部消瘦，颜色淡红，血管无色，部分病蛤腮黏液明显增多。

1.2 分离方法 无菌盐水洗净，用70%的酒精棉球对体表擦拭消毒，无菌手术刀开启，取肝胰脏等部位无菌匀浆器中匀浆处理，zobell 2216E平板和TCBS平板划线接种，28℃培养24h后，选取优势菌落进行重复划线纯化，纯培养物于4℃冰箱中保存。

1.3 人工感染试验 人工感染试验在20L水族箱中进行，温度28℃，盐度26.4，pH8.2，连续充气，每组放16只2cm大小的文蛤。换水1次/d，试验组调节水体中细菌浓度为108cfu/ml，投单胞藻1次/d；对照组不加入菌体，按上述方法饲养；连续观察12d，纪录死亡状况，并进行解剖和病原的再分离以确定是否死于攻毒活菌引起的感染。

1.4 细菌鉴定 按一般细菌常用鉴定方法[10]进行分离菌的生物学性状测定，包括革兰氏染色、形态观察、生理生化特性测定。

2 结果与分析

2.1 细菌分离及其形态特征 经分离纯化后，从病蛤中分离到1株优势菌，分离的菌株为革兰氏阴性直杆菌，菌体直或稍弯，无荚膜，靠鞭毛运动。在TCBS(硫代硫酸钠-柠檬酸盐-胆盐)琼脂平板上培养菌落成绿色，菌落直径为3～7mm。

2.2 人工感染试验 表1显示，该分离菌感染文蛤8d后开始死亡，12d的病死率为68.75%。于是初步判定该养殖场文蛤大批死亡是以该分离菌为主要病原体的传染病所致。

表1 人工感染死亡时间和死亡数量 (%)

2.3 分离菌株生化特性 该分离菌株无盐不生长，在含8%以上NaCl胨水中不生长，主要生化结果见表2。根据表2生化结果判定该菌为坎氏弧菌。

表3 分离菌株的生理生化特性

3 讨论

（1）本试验采用传统的生理生化分析技术，对从患病文蛤中分离的菌株进行了综合鉴定。通过生理生化实验可知，该分离菌株与坎氏弧菌标准菌株[11]基本相同，初步鉴定该分离菌株为坎氏弧菌。（2）坎氏弧菌是海洋环境中的常见菌，广泛分布于沿海水域，河口及水产品中。在人源致病性弧菌的诊断中也常检测到，如周明岛等[9]在调查海口市致病性弧菌分布时，从腹泻病人粪便中检出弧菌221株，其中有25株为坎氏弧菌，占11.3%，仅次于副溶血性弧菌。陈梅等[10]对山东近海主要养殖动物弧菌种类与分布的调查中，在鲈鱼和黑鲷体内检出多株坎氏弧菌。王祥红等[11]在研究中国对虾肠道微生物区系时发现中国对虾肠道弧菌属中坎氏弧菌占20%。沈晓盛从福建沿岸养殖太平洋牡蛎体内分离到4株坎氏弧菌，进一步说明坎氏弧菌在海洋水域及海水养殖贝类动物中也广泛分布[12]。（3）坎氏弧菌是水产养殖动物的条件致病弧菌之一，许兵等[13]报道了坎氏弧菌可引起养殖中国对虾红腿病，病菌可侵入循环系统导致败血症，是养殖对虾的一种常见病，危害较为严重。马键民等[14]报道坎氏弧菌是皱纹盘鲍脓毒败血症病原菌，病鲍腹足肌肉上可见大小不等的脓疮，血淋巴液和脓汁中充满大量杆菌，死亡率极高，是北方沿海养鲍业最主要的流行病。作者从江苏文蛤体内检出1株坎氏弧菌，国内也未见坎氏弧菌引起文蛤患病的报导。一般认为，弧菌是一种条件致病菌，是水产养殖动物体内外和养殖环境中的正常菌群，当环境条件异常，导致弧菌大量繁殖时或养殖动物因种种原因，体质下降时，往往会引起弧菌病的暴发流行。作者从文蛤中分离到的1株坎氏弧菌，说明该菌对文蛤养殖业具有潜在的危险，应引起足够重视。

[1] 吴信忠. 海洋养殖贝类病害的流行状况及其控制对策[J]. 广州:广东经济出版社, 1998, pp. 670679.

[2] 王斌, 王翔, 王莉明等. 我国主要养殖贝类微生物性疾病研究进展[J]. 海洋环境科学, 2000, 21(3): 7680.

[3] Sen YL, Yu YS. Pathogenicity of vibrio paraheamolyticus to healthy clam Meretrix meretrix and the prevention and treatment of vibrio infections. Fisheries China, 1993, 17(3): 249252.

[4] 杨美桂. 新竹区养殖文蛤病原菌vibrao paraheamolyticus之分离[A].农发会鱼病研究集(二)[C], 1978, pp. 5967.

[5] 阎冰, 洪家明, 刘军义等. 文蛤副溶血弧菌病的研究[J]. 微生物学杂志, 1996, 16(4): 15.

[6] 刘军义. 广西沿海文蛤及其生境中细菌菌群的初步调查[J]. 水产科技情报, 1996, 23(2): 8083.

[7] 王广和, 沈艳云, 沙培荣等. 文蛤弗尼斯弧菌病研究[J]. 微生物学通报, 1992, 19(4): 222225.

[8] 郑国兴, 李何, 黄宁宇等. 文蛤病原菌(溶藻弧菌)的分离与性状及病文蛤组织的电镜观察[J]. 水产学报, 1991, 15(2): 8595.

[9] 周明岛, 徐海英, 傅海玲等. 海口市政病性孤菌分布的调查[J]. 中华流行病学杂志, 1991, 12(特3): 13-16.

[10] 陈梅, 王奎旗, 徐怀恕. 山东近海主要养殖动物的孤菌检测与病害防治的研究[10]. 齐鲁渔业, 2000,17(6): 6-81.

[11] 王祥红, 李军, 祁白忠等. 中国对虾肠道微生物区系的研究, 对虾苗期细菌病害的诊断与控制[M]. 北京: 海洋出版社,1999,84-87.

[12] 沈晓盛, 蔡友琼, 房文红等. 养殖牡蛎体内检出坎氏弧菌的鉴定[J]. 微生物学报. 2005, 45(2): 177-179.

[13] 许兵, 纪伟尚, 徐怀恕. 中国对虾病原菌及致病机理的研究[J].海洋学报, 1993,15(1): 98-106.

[14] 马健民, 王琦, 马福恒等. 皱纹盘鲍脓毒败血症病原菌的发现及初步研究[J]. 水产学报, 1996,20(4): 332-336.

S852.61+3

A

1007-1733(2014)06-0022-02

2014–02–24）

浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室开放基金(J2013006)；浙江省科技计划项目(2012C22072，2012F20029)；浙江省自然科学基金(Y14C190013).

*通讯作者