维生素C对三氧化二砷抑制上皮性卵巢癌增殖的增敏效应研究

高克非，曾根

（1.广州中医药大学第一附属医院妇科，广东广州 510405；2.海南省中医院妇产科，海南海口 570203)

维生素C对三氧化二砷抑制上皮性卵巢癌增殖的增敏效应研究

高克非1，曾根2

（1.广州中医药大学第一附属医院妇科，广东广州 510405；2.海南省中医院妇产科，海南海口 570203)

目的观察维生素C对三氧化二砷(AS2O3)抑制上皮性卵巢癌细胞株的化疗增敏效应并探讨其凋亡蛋白相关机制。方法以上皮性卵巢癌细胞株OVCAR-3为研究对象，以噻唑蓝(MTT)药敏试验、流式细胞仪以及蛋白质印迹法检测维生素C对AS2O3化疗的增敏效应及其机制。结果AS2O3和Vitamin C单药对上皮性卵巢癌细胞株均具有剂量依赖性的生长抑制作用，IC50值分别为4.72 μmol/L和21.85 μmol/L。AS2O3联合Vitamin C的实验中，OVCAR-3细胞株的增殖抑制率均大于同浓度AS2O3单药的抑制率，P值分别为0.001和0. 012；两组联合用药的q值分别为2.71和1.63，均大于1.15，提示两药联合具有协同抑制效应。流式细胞检测显示，AS2O3联合Vitamin C后S期阻滞效应明显，凋亡率增加。蛋白质印记法结果显示，两药联合作用后，Bcl-2表达明显下调，Bax表达明显上调。结论在上皮性卵巢癌细胞株，一定浓度范围的Vitamin C对AS2O3具有较好的化疗增敏效应，AS2O3和Vitamin C的联合应用具有进一步研究的价值。

维生素C；三氧化二砷；化疗；卵巢癌

卵巢癌是死亡率最高的一类妇科恶性肿瘤，卵巢癌的化疗及化疗研究在卵巢癌治疗和科研中占有非常重要的地位。三氧化二砷(AS2O3)是从血液病向实体瘤扩展应用研究的一类凋亡诱导药物，目前在血液病和包含卵巢癌在内的多种实体瘤均有研究报道[1-4]，同时有研究证明维生素C对AS2O3具有良好的化疗增敏效应，该效应可以使AS2O3的应用剂量降低从而减轻其毒副作用，同时提高其药效，而该效应在卵巢癌鲜有报道。因此，本研究拟在上皮性卵巢癌细胞株中观察维生素C对AS2O3的化疗增敏效应，尝试在体外探讨这两种药物相结合作为卵巢癌化疗方法的可行性。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂人上皮性卵巢癌细胞株OVCAR-3细胞株由中山大学肿瘤防治中心实验研究部符立梧教授、梁永矩老师惠赠。RPMI-1640培养液为美国GIBCO公司产品，优级胎牛血清(FBS)为杭州四季青公司产品。亚砷酸注射液为伊达药业有限公司惠赠。维生素C注射液为南京金陵药液有限公司产品。胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均为美国Sigma公司产品。酶标仪型号BIO-TEK ELX800，流式细胞仪型号Beckman-Coulterc ELITE。Bcl-2、Bax抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国SantaCruz公司。

1.2 细胞培养上皮性卵巢癌细胞株OVCAR-3于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，细胞呈贴壁生长。

1.3 MTT实验取处于对数生长期的OVCAR-3，以2.5×103/孔接种于96孔板，常规培养24 h，更换含不同浓度的Vitamin C和AS2O3的培养液。实验分为Vitamin C单药、AS2O3单药、AS2O3联合Vitamin C剂量依赖和同一联合浓度时间依赖等4个部分。两种药物的单药实验均等比设置了5个药物浓度梯度，联合药物实验首先设置了1.24 μmol/L和2.48 μmol/L的AS2O3均联合1.39 μmol/L的Vitamin C进行检测，再将固定浓度2.48 μmol/L的AS2O3联合1.39 μmol/L的Vitamin C分别在24 h、48 h和72 h进行时间依赖性细胞抑制观察。细胞培养68 h后加入MTT溶液(10 mg/ml)10 μl，再放入培养箱反应4 h，加入DMSO振荡，上酶标仪测定OD值(A 570 nm)。实验重复3次，取3次实验结果的平均值作为实验结果。肿瘤细胞增殖抑制率＝[1-(物处理组A值-空白对照组A值)/(细胞对照组A值-空白对照组A值)]× 100%。按金氏公式[q=Ea+b/Ea+Eb-Ea×Eb]计算所得q值评价两种药物联合作用效果，式中Ea+b为联合用药的有效率，Ea和Eb分别为两种药物单药的有效率，q值在0.85～1.15范围为两药合用呈单纯相加效应，q值大于1.15为两药合用具有协同效应，q值小于0.85为两药合用具有拮抗效应。

1.4 流式细胞仪检测OVCAR-3细胞培养24 h后以不同浓度的AS2O3、Vitamin C单药培养液或不同浓度的Vitamin C联合AS2O3培养液处理细胞48 h(各处理组的药物浓度详见图1)。收集全部细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，冰预冷70%乙醇固定，1 500 r/min，离心半径15 cm，离心5 min，1%RNAase和PI染液处理，行流式细胞仪检测凋亡比率及细胞周期。CELLQuest软件采集样本，ModFit LT软件分析结果。观察浓度依赖性的凋亡情况和细胞周期的变化。实验重复3次，实验结果以“均数±标准误”表示。

1.5 蛋白质印迹法检测检测凋亡相关蛋白的表达OVCAR-3细胞经2.48 μmol/L的AS2O3单药和分别联合1.39 μmol/L、2.77 μmol/L Vitamin C作用12 h后，按常规方法提取总蛋白，经蛋白定量后以SDS-PAGE电泳分离蛋白，电转至硝酸纤维素膜，室温下用3%小牛血清封闭1 h，随后加入1.5%BSA稀释的一抗，轻摇过夜，TBST缓冲液洗4次，于1.5% BSA稀释的二抗中孵育1 h，TBST洗4次，ECL化学发光试剂反应2 min，照相、分析、保存。

1.6 统计学方法采用SPSS17.0统计软件，IC50值的计算采用概率单位法。样本间均数的比较采用配对资料t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS2O3和Vitamin C单药及联合对OVCAR-3细胞株的生长抑制作用MTT实验中，AS2O3和Vitamin C对OVCAR-3细胞株均呈现药物浓度依赖性的生长抑制作用，其抑制细胞增殖的IC50值分别为4.72 μmol/L和21.85 μmol/L(图1A、图1B)。AS2O3联合Vitamin C的实验中，OVCAR-3细胞株的增殖抑制率均大于同浓度AS2O3单药的抑制率。将联合用药的OD值与AS2O3单药的OD值进行t检验，结果显示，两组的P值分别为0.001和0.012(图1 C)。1.24 μmol/LAS2O3单药的抑制率为7.9%，2.48 μmol/L AS2O3单药的抑制率为24.6%，1.39 μmol/L的Vitamin C的单药抑制率为3.0%，按金氏公式计算两联合用药组的q值分别为2.71和1.63。取2.48 μmol/LAS2O3联合1.39 μmol/L的Vitamin C分别于24 h、48 h和72 h观察抑制率，三个时间点的联合作用q值分别为1.49、1.52、1.63(图1 D)。以上浓度依赖和时间依赖的联合实验P值均小于0.05，q值均大于1.15，提示一定浓度的Vitamin C对AS2O3具有明显的化疗增敏效应，并且两药联合具有协同效应。

图1 AS2O3和Vitamin C单药及联合对OVCAR-3细胞株均的生长抑制作用（药物作用72 h）

2.2 AS2O3联合Vitamin C对OVCAR-3细胞凋亡及细胞周期的影响流式细胞仪检测AS2O3联合不同浓度Vitamin C实验结果显示，2.48 μmol/LAS2O3单药以及与1.39 μmol/L、2.77 μmol/L、5.54 μmol/L的Vitamin C联合后，其诱导凋亡率逐步升高，各联合用药的凋亡率与AS2O3单药组比较经统计学检验，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表1、图2。细胞周期结果显示，在联合了Vitamin C之后，不仅细胞凋亡比率增加，其S期的比率增加也较显著，而G2/M期的比例较AS2O3单药组降低。各联合用药的S期比率与AS2O3单药组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表1、图2。

2.3 AS2O3单药及联合不同浓度Vitamin C作用后OVCAR-3细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达见图3，OVCAR-3细胞经AS2O3单药及与不同浓度的Vitamin C联合作用，随着Vitamin C浓度的增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达逐渐降低，凋亡促进蛋白Bax的表达逐渐升高。

表1 AS2O3联合Vitamin C对OVCAR-3细胞凋亡及细胞周期的影响(药物作用48 h，±s)

表1 AS2O3联合Vitamin C对OVCAR-3细胞凋亡及细胞周期的影响(药物作用48 h，±s)

组别细胞周期比率(%)空白对照AS2O32.48 μmol/L AS2O32.48 μmol/L+Vit C 1.39 μmol/L AS2O32.48 μmol/L+Vit C 2.77 μmol/L AS2O32.48 μmol/L+Vit C 5.54 μmol/L凋亡率(%) 3.7±1.2 10.3±1.5 26.1±1.0a31.5±1.8a36.1±1.9aG1 S 68.8±2.2 28.4±1.1 37.3±1.0 32.8±1.2 28.0±0.6 24.7±2.5 25.7±0.5 32.9±0.9a43.8±1.8a47.0±1.5aG2/M 6.5±1.8 45.9±0.8 29.7±1.1 23.6±1.0 25.0±1.3

图2 流式细胞仪检测AS2O3联合Vitamin C对OVCAR-3细胞株的诱导凋亡和细胞周期阻滞作用

图3 AS2O3单药及联合不同浓度Vitamin C作用12 h后OVCAR-3细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达

3 讨论

AS2O3对以早幼粒细胞白血病(APL)为代表的血液系统恶性疾病的疗效为全世界所公认，并且该药对实体瘤治疗的有效性也得到了广泛的研究和认可。研究证实，AS2O3对非耐药和耐药的卵巢癌细胞株均有抑制作用[1，5]。具有双向氧化还原性质的维生素C，利用其作为前氧化剂的特点，可降低细胞内GSH水平，已证明对AS2O3具有较好的化疗增敏效应，在肺癌、肝癌、结直肠癌等实体瘤方面已有报道[6-8]，但在卵巢癌方面鲜有相关报道。因此，本研究以卵巢癌细胞株OVCAR-3为研究对象，探讨Vitamin C对AS2O3的增敏效应及其凋亡蛋白相关的分子机制。

本研究显示，AS2O3和Vitamin C单药对OVCAR-3细胞均具有剂量依赖性的抗肿瘤效应，二者的IC50值分别为4.72 μmol/L和21.85 μmol/L。AS2O3联合Vitamin C的实验中，OVCAR-3细胞株的增殖抑制率均大于同浓度AS2O3单药的抑制率，且P＜0.05，由此可见，一定浓度的Vitamin C对AS2O3具有明显的化疗增敏效应。流式细胞仪的检测从细胞周期和细胞凋亡角度进一步证实了Vitamin C对AS2O3具有明显的促进凋亡作用，并且联合作用后的S期阻滞效应明显。应用蛋白质印迹法检测Vitamin C对AS2O3的化疗增敏效应，可见凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达较AS2O3单药作用明显降低，而凋亡促进蛋白Bax表达进行性升高。

国内蒋碧佳等[8]对肺腺癌进行细胞及裸鼠移植瘤的系列研究，结果显示AS2O3和Vitamin C联合用药组在增殖抑制、诱导凋亡方面均高于单药用药组，其机制与Survivin和VEGF的表达下调有关。本研究的结果与以上肺癌的研究结论相一致，说明AS2O3和Vitamin C这两种药物在包括肺癌、卵巢癌在内的实体瘤方面均具有切实的联合用药效果。Caspase和Bcl-2两个蛋白家族都是凋亡通路中的重要蛋白，二者既相互联系，作用机制又有区别。本研究在凋亡方面将Bcl-2和Bax这两种Bcl-2家族蛋白作为研究对象，结果显示出联合用药的Bcl-2表达下调和Bax的表达上调均高于单药组，结合肺癌的研究结果，提示包括Caspase和Bcl-2等家族蛋白在内的不同的凋亡通路和分子可能都参与了AS2O3和Vitamin C联合用药的促凋亡机制，而Galimberti等[9]的研究结果同样证实了Bcl-2家族的参与。

有关Vitamin C对AS2O3增敏作用的基础机制，现有研究显示：AS2O3是直接作用于线粒体，增加线粒体内活性氧簇(ROS)的生成，并使其氧化还原系统丧失，而细胞内GSH水平是细胞对AS2O3诱导凋亡敏感性的关键[10-11]；在白血病细胞和肺成纤维细胞中Vitamin C提高AS2O3疗效的主要机制是降低细胞内GSH水平，从而提高AS2O3诱导的ROS水平，加剧线粒体的氧化损伤促进凋亡进程[11-12]，在卵巢癌细胞中维生素C的增敏机制是否与血液病相同呢？本课题组下一步将对OVCAR-3细胞中维生素C的氧化应激调节的分子机制进一步求证，并开展相关动物实验，以期为临床试验打下坚实的基础。

[1]Kodigepalli KM,Dutta PS,Bauckman KA,et al.SnoN/SkiL expression is modulated via arsenic trioxide-induced activation of the PI3K/AKT pathway in ovarian cancer cells[J].FEBS Lett,2013, 587(1):5-16.

[2]凌燕,蒲祖辉,卓家才,等.亚砷酸和维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病疗效与安全性的系统评价[J].海南医学,2011,22(13):9-11.

[3]温小明,程惠安,招卫乾.应用亚砷酸艾迪治疗晚期肝癌临床分析[J].海南医学,2010,21(15):15-17.

[4]陈学娟,张向宁,王凤琴,等.三氧化二砷对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭转移能力的影响[J].现代妇产科进展,2011,20(3):225-228.

[5]黄守国,孔北华,马玉燕,等.三氧化二砷对人卵巢癌耐药细胞株细胞增殖和转移能力的影响[J].癌症,2002,21(8):863-867.

[6]Li JJ,Tang Q,Li Y,et al.Role of oxidative stress in the apoptosis of hepatocellular carcinoma induced by combination of arsenic trioxide and ascorbic acid[J].Acta Pharmacol Sin,2006,27(8): 1078-1084.

[7]Subbarayan PR,Lima M,Ardalan B.Arsenic trioxide/ascorbic acid therapy in patients with refractory metastatic colorectal carcinoma: a clinical experience[J].Acta Oncol,2007,46(4):557-561.

[8]蒋碧佳,曾锦荣,王绩英,等.三氧化二砷联合维生素C抑制耐药性肺腺癌裸鼠移植瘤生长机制的研究[J].中国实验方剂学杂志, 2011,17(14):196-200.

[9]Galimberti S,Guerrini F,Salvi F,et al.Arsenic trioxide and ascorbic acid interfere with the BCL2 family genes in patients with myelodysplastic syndromes:an ex-vivo study[J].J Hematol Oncol,2012, 5(1):1-8.

[10]Zhou J.Arsenic trioxide:an ancient drug revived[J].Chin Med J (Engl),2012,125(19):3556-3560.

[11]You BR,Park WH.Arsenic trioxide induces human pulmonary fibroblast cell death via increasing ROS levels and GSH depletion[J]. Oncol Rep,2012,28(2):749-757.

[12]Pelicano H,Feng L,Zhou Y,et al.Inhibition of mitochondrial respiration:a novel strategy to enhance drug-induced apoptosis in human leukemia cells by a reactive oxygen species-mediated mechanism[J].J Biol Chem,2003,278(39):37832-37839.

Role of Vitamin C as a sensitizer for arsenic trioxide in epithelial ovarian cancer cells.

GAO Ke-fei1，ZENG Gen2. 1.Department of Gynecology,the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405,Guangdong,CHINA;2.Department of Gynecology and Obstetrics,Hainan Provincial Traditional Chinese Medicine Hospital,Haikou 570203,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the role of Vitamin C as a sensitizer for arsenic trioxide in epithelial ovarian cancer cells and the apoptotic mechanisms.MethodsIn OVCAR-3 cells,the anti-cancer effects were observed when Vitamin C or AS2O3was given alone,and the sensitizing effects of Vitamin C were observed when it was used in the combination with arsenic trioxide.MTT chemosensitivity test,Flow Cytometry for examination of apoptosis and cell cycle status and Western-blot were applied.ResultsDose-dependent antiproliferative effect on epithelial ovarian cancer cell lines was observed when Vitamin C or AS2O3was applied as single agent,the IC50 value was 4.72 μmol/L and 21.85μmol/L respectively.When the two agents were applied simultaneously,the growth inhibition rate was significantly higher than that of the group treated with AS2O3alone,and the P value of the two combined regimen experiments were 0.001,0.012 respectively,the q value of the combined effects was 2.71,1.63 respectively. These results showed synergistic effect of the two agents.Flow Cytometry testing showed significant S phase block and increased apoptosis rate in the combination treatment group.In Western-blot experiments,Bcl-2 expression of the combination treatment group was down-regulated，and Bax expression was up-regulated compared with the group treated by AS2O3alone.ConclusionVitamin C has sensitizing effect on arsenic trioxide in the treatment of epithelial ovarian cancer cell lines,which should be promising in the further study.

Vitamin C;Arsenic trioxide;Chemotherapy;Ovarian carcinoma

R737.31

A

1003—6350（2014）16—2350—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0919

2014-04-26)

高克非。E-mail：schsums@163.com