电刺激嗅球对脑缺血再灌注大鼠内源性神经干细胞增殖、迁移及分化的影响

张广慧 吴方荣 何明利 郭振委 秦新月

电刺激嗅球对脑缺血再灌注大鼠内源性神经干细胞增殖、迁移及分化的影响

张广慧 吴方荣 何明利 郭振委 秦新月

目的 探讨嗅球电刺激对脑缺血再灌注大鼠脑内神经发生的影响。方法 将健康雌性SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、电刺激组、假刺激组，其中脑缺血再灌注组、电刺激组，以线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）/再灌注模型，假手术组仅分离出颈内动脉；电刺激组在右侧嗅球内埋置双极电极，于MCAO再灌注后对嗅球进行电刺激，假刺激组只埋置电极，不进行电刺激；以5—溴脱氧尿嘧啶（Brdu）标记内源性神经干细胞（NSC）。假手术组于术后48 h、1周，脑缺血再灌注组于缺血再灌注后48 h、1周，电刺激组及假刺激组于刺激后48 h、1周分别行Brdu免疫组化染色，观察各组脑室下区（SVZ）区NSC增殖情况；假手术组、缺血再灌注组、电刺激组、假刺激组4组大鼠在电刺激组行电刺激后腹腔注射Brdu 50 mg/kg，2次/d，连续2 d，4周后处死，分别取脑切片，进行免疫组化和免疫荧光双标染色，观察各组NSC迁移和分化情况。结果 缺血再灌注组（37.67±1.97）、假刺激组（36.5±2.35）和电刺激组（43.67±1.63）大鼠48 h后SVZ区Brdu阳性NSC细胞数较假手术组（15.5±1.52）明显增多（=57.21，＜0.05），缺血再灌注组（41.17±2.94）、假刺激组（41.83±2.14）和电刺激组（47.67±2.34）1周后Brdu阳性细胞数较假手术组（15.5±1.52）增多（=73.62，＜0.01），电刺激组在各时间点均较其他组Brdu阳性NSC细胞数增多（＜0.01）。缺血并注射Brdu 4周后缺血侧皮质区电刺激组Brdu阳性NSC细胞数（57.17±2.4）较缺血再灌注组（46.83±2.48）和假刺激组（45.83±2.14）增多（=161.50，＜0.01）；免疫荧光双标染色示电刺激组Brdu阳性NSC细胞中Brdu/神经元核抗原（Neun）双阳性细胞比例约为（74.67±3.61）%，Brdu/胶质纤维酸性蛋白（GFAP）双阳性细胞比例约为（38.83±3.36）%，与缺血再灌注组和假刺激组比较差异均无统计学意义（均＞0.05）。结论 电刺激嗅球可能促进脑缺血大鼠SVZ区NSC增殖，并可能促进新生NSC向缺血皮质区迁移，增加缺血皮质新生神经元数量，但SVZ区新生NSC的分化不受影响。

电刺激；缺血再灌注；神经发生，大鼠

目前已经公认，生理条件下，在成年中枢神经系统中海马齿状回（dentategyms，DG）的颗粒下层（subgranulazone，SGZ）和脑室下区（subventricular zone，SVZ）两个区域存在神经干细胞（neural stem cell，NSC）［1］。有研究发现，脑缺血可激活自体NSC增殖［2］，但增殖的NSC数量有限，且只有少部分能够存活。如何增加内源性神经发生，诱导NSC向损伤脑区迁移，仍有待于进一步研究。本文作者的前期工作研究表明，电刺激嗅球能促进正常大鼠SVZ区NSC的增殖和迁移，但其对脑缺血大鼠内源性NSC增殖和迁移的影响尚未知［3］，国内外也未见相关报道。本研究拟观察电刺激嗅球对脑缺血再灌注大鼠SVZ区NSC增殖、向缺血区迁移及其分化的影响，期望为治疗脑梗死提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物：健康成年雌性清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠72只，体质量250～280 g，购于重庆医科大学动物实验中心。大鼠接受自然昼夜规律光照，饲养周围环境温度为25℃左右，自由饮水、摄食。

1.1.2 主要试剂和仪器：Brdu（sigma公司），鼠抗Brdu单克隆抗体（Chemicon公司），兔抗神经元核抗原（neuronal nuclei antigen，Neun）单克隆抗体（博奥森公司），兔抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗体、FITC标记的荧光二抗及TRITC标记的荧光二抗（武汉博士德公司），SP通用试剂盒（北京中衫公司）。倒置相差显微镜及荧光显微镜（Olympus公司，日本），多导电生理仪（BIOPAC system MP100）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制作：将大鼠随机分为假手术组（18只）、脑缺血再灌注组（18只）、电刺激组（18只）、假刺激组（18只）。参照Xu等［4］的方法，对脑缺血再灌注组、电刺激组、假刺激组大鼠，运用线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）/再灌注模型。根据Zea Longa的神经功能评分标准［5］，将虽然有症状，但神经功能评分小于1分的大鼠排除。因各种因素致动物数量不足者通过随机抽样原则补齐。假手术组仅分离出颈内动脉，不插入栓子。据Linster等［6］的方法制作嗅球电刺激模型，电刺激组及假刺激组安放电极后行脑缺血再灌注。大鼠按体质量350 mg/kg以水合氯醛腹腔内注射麻醉后，取头部正中切口，暴露颅骨。根据Paxinos脑图谱［7］，在右侧嗅球内，以前囟为原点，取前囟前7.1 mm，中线旁右侧1.7 mm，硬膜下3.8 mm为靶点，垂直插入不锈钢双极电极，电极焊接到一个小型插头，然后用牙科水泥固定插头。缺血再灌注后立即给予电刺激干预。以多导电生理仪进行电刺激，直流方波，电流10μA，时程0.5 ms，频率50 Hz，1次/d，每次1 h。假刺激组安置电极后不给予电刺激干预，余操作同电刺激组。

1.2.2 SVZ区NSC增殖情况检测：假手术组于术后48 h、1周，脑缺血再灌注组于缺血再灌注后48 h、1周，电刺激组及假刺激组于电刺激后48 h、1周各取6只大鼠处死（大鼠于处死前1 d腹腔注射Brdu按体质量50 mg/kg，共注射3次，每次间隔4 h），经主动脉以4%（质量浓度）多聚甲醛（PFA）灌注取脑，置于4%（质量浓度）PFA中进行后固定，石蜡包埋后制作石蜡切片，在前囟点正中前0.1～0.3 mm处收集10张10μm厚切片，参照说明书进行Brdu免疫组化染色，DAB显色后常规脱水、透明、封片。Brdu阳性细胞为胞核染色呈淡黄色；于400倍显微镜下观察切片并摄片，随机选择5个非重叠视野，以缺血侧SVZ区、皮质为观察部位，每只动物的每个部位随机选取5张非连续切片，计数每个视野的阳性细胞数后计算每只大鼠所要分析部位的平均Brdu阳性细胞数。

1.2.3 NSC迁移和分化情况：假手术组、缺血再灌注组、电刺激组、假刺激组四组大鼠（每组6只）在电刺激组行电刺激后经腹腔注射Brdu按体质量50 mg/kg，2次/d×2 d，4周后处死，分别取脑，行冠状位切片，放入4%（质量浓度）PFA中固定，24 h内取出，石蜡包埋，制作石蜡切片，片厚10 μm，收集前囟点正中前0.1～0.3 mm处10张切片，进行Brdu/Neu N、Brdu/GFAP免疫荧光双标染色：切片经HCL、胰酶等变性、抗原修复及血清封闭后，加入鼠抗Brd U抗体（1∶100）和兔抗Neu N（1∶50）或兔抗GFAP（1∶50）抗体，4℃过夜，加入TRITC标记的羊抗鼠IgG（1∶50）与FITC标记的羊抗兔Ig G（1∶50）混合抗体，室温孵育2 h，50%（体积分数）缓冲甘油封片，于200倍荧光显微镜下照相，观察新生细胞的迁移和分化情况。将Brdu阳性细胞判断为新生细胞，皮质区出现的阳性细胞认为是迁移细胞，细胞同时表达Brdu/Neu N、Brdu/GFAP认为是发生分化。参照Nakatomi等［8］的方法在每张切片缺血侧皮质区截取10个400倍视野，计数双标阳性细胞（Brdu/ NeuN或Brdu/GFAP）数和Brdu阳性细胞总数，然后分别计算Brdu/Neu N、Brdu/GFAP阳性细胞数占Brdu阳性细胞总数的百分比。Brdu阳性细胞为红色荧光，GFAP和Neun阳性细胞为绿色荧光。Brdu/Neun双阳性细胞呈现为淡黄色。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0软件进行分析。所有数据均以均数±标准差（± ）表示。假手术组、脑缺血再灌注组、假刺激组、电刺激组四组间Brdu阳性细胞数比较采用ANOVA单因素方差分析，率的比较采用卡方检验。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Brdu免疫组化染色 缺血再灌注组、电刺激组，假刺激组SVZ区Brdu阳性细胞数在大鼠脑缺血后48 h均较假手术组明显增多，1周时更为明显；电刺激组各时间点阳性细胞数均较其他组相应时间点多（48 h时：=57.21，＜0.05；1周时：=73.62，＜0.01）。电刺激后4周时假手术组大鼠右侧皮质区只有极少数Brdu阳性细胞，缺血再灌注组、假刺激组和电刺激组缺血侧皮质区可见大量Brdu阳性细胞，其中电刺激组Brdu阳性细胞数较缺血再灌注组和假刺激组增多（= 161.50，＜0.01）（表1，图1、2）。

2.2 Brdu/Neun和Brdu/GFAP免疫荧光双标染色 在电刺激组Brdu阳性细胞中，Brdu/Neun双阳性细胞比例约为（74.67±3.61）%，Brdu/GFAP双阳性细胞比例约为（38.83±3.36）%，与缺血再灌注组和假刺激组比较差异均无统计学意义（均＞0.05）（表1，图3）。

表1 各组大鼠Brdu阳性细胞计数及缺血侧皮质Brdu/Neun和Brdu/GFAP双阳性细胞表达比较 （±，=6）

表1 各组大鼠Brdu阳性细胞计数及缺血侧皮质Brdu/Neun和Brdu/GFAP双阳性细胞表达比较 （±，=6）

注：与假手术组比较，#＜0.01；与缺血再灌注组比较，*＜0.01

组别 Brdu阳性细胞SVZ区48 h SVZ区1周 皮质区4周Brdu/Neun阳性细胞（%） Brdu/GFAP阳性细胞（%）电刺激组 43.67±1.63#* 47.67±2.34#* 57.17±2.4#* 74.67±3.61 38.83±3.36假刺激组 36.5±2.35# 41.83±2.14# 45.83±2.14# 76.17±4.95 36.83±3.54缺血再灌注组 37.67±1.97# 41.17±2.94# 46.83±2.48# 71.00±5.45 35.67±2.66假手术组 15.5±1.52 15.5±1.52 6.5±1.83 71.76±5.82 36.59±2.94

图1 大鼠缺血侧SVZ区Brdu阳性NSC表达（免疫组化；标尺：75μm）

图2 大鼠缺血侧皮质Brdu阳性新生细胞（免疫组化；标尺：75μm）

图3 大鼠缺血侧皮质NSC的分化（免疫荧光双标染色；标尺：50μm）

3 讨论

脑梗死具有很高的致残率，是严重危害人体健康的一种疾病，人们一直希望能够找到一种理想的修复缺血受损的脑组织的方法，即新生的神经元来替代死亡的神经元，修复受损的神经组织，从而使丧失的神经功能完全或基本恢复。近来中枢神经系统内存在NSC的发现为脑梗死的治疗带来了新的希望。

Altman等［9］于1965年首次发现在成年哺乳动物脑内某些区域不断出现新的神经元，这些神经元被认为来源于干细胞群。后来Reynolds等［10］于1992年在成年鼠纹状体分离到NSC，证实源于成年脑内的NSC可通过体外扩增获得，且这些细胞具有自我更新和分化为神经元和胶质细胞的能力。各种病理条件下，如脑缺血［11］、脑外伤［12］等，均可促进内源性NSC增殖，但由于SVZ区NSC增殖、向病灶区迁移、存活及分化能力有限等原因，其修复功能仍不甚理想。作者前期研究表明，电刺激嗅球能促进正常大鼠SVZ区NSC增殖和迁移；本研究中对脑缺血再灌注大鼠进行嗅球电刺激，进一步发现脑缺血再灌注后48 h及1周，电刺激组大鼠SVZ区Brdu阳性细胞数较缺血再灌注组明显增多，表明电刺激嗅球也能促进脑缺血大鼠内源性NSC增殖。脑缺血后内源性NSC激活可能与某些细胞因子、营养因子的自分泌或旁分泌有关，特别是有丝分裂原物质如表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等的释放。Lin等［13］的研究结果显示，脑缺血再灌注后海马部位b FGF m RNA于缺血后60 min开始增高，持续2周，表达的时间规律与海马齿状回的NSC增殖程度基本一致。Leker等［14］对局灶性脑缺血大鼠进行了转染bFGF的腺病毒干预，发现干预组NSC增殖较正常对照组明显增强，神经功能恢复更为明显。Nakatomi等［8］还发现，向脑缺血大鼠侧脑室内注入神经生长因子可显著促进内源性NSC增殖。本研究结果显示，电刺激嗅球可促进NSC的增殖，推测这可能与电刺激嗅球诱导脑内某些上述活性因子的表达升高有关。

另外，本研究还发现，大鼠脑缺血再灌注后4周，缺血皮质周围存在大量Brdu阳性细胞，且电刺激组Brdu阳性细胞数量与缺血再灌注组比较增多，表明电刺激嗅球也可能促进SVZ区NSC向缺血区迁移，增加缺血区皮质NSC数量，从而参与缺血后的损伤修复作用。荧光双标染色显示假手术组和电刺激组Brdu阳性细胞大部分同时表达Neun，少部分同时表达GFAP，表明缺血诱导的NSC主要分化为神经元，但两组中NSC分化为神经元的比例差异无统计学意义，提示电刺激嗅球可能不影响NSC的分化。NSC定向迁移的机制十分复杂，神经前体细胞的迁移类似于“阿米巴”运动，以正切和放射状两种方式迁徙［15］。多唾液酸-神经细胞黏附分子（polysialylated neural celladhesion molecule，PSA-NCAM）是一种介导细胞间黏附和识别的糖蛋白，多唾液酸的修饰可显著降低NCAM的黏附，增加细胞之间相互排斥的能力，迁徙细胞表面表达的NCAM可与胶质细胞形成特定的放射状纤维管状结构，指引细胞迁移，因此推测PSA-NCAM对SVZ的迁移具有重要的作用。嗅球与大脑皮层有广泛的纤维联系，电刺激嗅球可能可促进缺血皮质PSA-NCAM等分子的表达，从而促进NSC向病灶区定向迁移，其具体机制仍有待于更深入的研究和证实。

总之，本研究结果显示，电刺激嗅球有可能促进脑缺血再灌注大鼠SVZ区NSC增殖，增加缺血皮质新生干细胞数量，可能促进SVZ区NSC向缺血皮质迁移，从而参与缺血损伤后的神经修复作用，而且新生NSC的分化功能不受影响，其具体机制尚有待于进一步研究。

［1］Lois C，Alvarez-Buylla A.Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain［J］.Science，1994，264：1145-1148.

［2］张波，王任直，刘建勇，等.鼠脑梗死后自体神经干细胞的原位增殖、分化及其可塑性［J］.中华神经外科杂志，2004，20：400-404.

［3］张广慧，秦新月，王恬竹，等.电刺激嗅球对脑室下区神经干细胞增殖、迁移和分化的影响［J］.中华神经外科杂志，2011，27：729-732.

［4］Xu Z，Ford BD.Upregulation of erb B receptors in rat brain after middle cerebral arterial occlusion［J］.Neurosci Lett，2005，375：181-186.

［5］Zea-Longa E，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20：84-91.

［6］Linster C，Hasselmo ME.Neural activity in the horizontal limb of the diagonal band of broca can be modulated by electrical stimulation of the olfactory bulb and cortex in rats［J］. Neurosci Lett，2000，24，282（3）：157-160.

［7］Paxinos G，Watson C.The rat Brain in stereotaxic coordinates［M］.Sydney：Academic Press，1986.74-90.

［8］Nakatomi H，Kuriu T，Okabe S，et al.Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors［J］.Cell，2002，110：429-441.

［9］Altman J，Das GD.Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats［J］.J Comp Neurol，1965，124：319-335.

［10］Reynolds，BA，Weiss S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system［J］.Science，1992，255（5052）：1707-1710.

［11］吕威力，邢雪松，张玲，等.b FGF在局灶性脑缺血后内源性神经干细胞增殖过程中对Id2的影响［J］.解剖学研究，2011，33：9-12.

［12］刘阳，刘卫平，王孝安，等.神经生长因子与表皮生长因子干预创伤性脑损伤后内源性神经干细胞的增殖［J］.中国组织工程研究，2012，16：65-69.

［13］Lin TN，Te J，Lee M，et al.Induction of basic fibroblast growth factor（bFGF）expression following focal cerebral ischemia［J］.Brain Res，1997，49：255-265.

［14］Leker RR，Soldner F，Velasco I，et al.Long-lasting regeneration after ischemia in the cerebral cortex［J］.Stroke，2007，38：153-161.

［15］Jamba L，Nehru B，Bansal MP.Redox modulation of selenium binding proteins by cadmium exposures in mice［J］.Mol Cell Biochem，1997，177：169-175.

QIN Xin-yue，Email：qinxy20011@sina.com

Objective To investigate the effect of olfactory bulb（OB）electrical stimulation on neurogenesis of rats suffered from ischemia/reperfusion injury.Methods Healthy adult female Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into the sham-operation group，the ischemia/reperfusion（I/R）group，the stimulation group，and the sham-stimulation group.Cerebral ischemia/reperfusion in the I/R group and the stimulation/sham-stimulation group was induced by intraluminal right middle cerebral artery occlusion（MCAO）. Arteries in the sham-operation group were dissected but not occluded.Electrical stimulation was performed via a bipolar electrode implanted in the right OB of rats，and rats in the sham-stimulation group were implanted electrodes but not stimulated.Bromodeoxyuridine（Brdu）was injected intraperitoneally to label endogenous neural stem cells（NSC）.The animals in all groups were sacrificed at 48 h，1 week after corresponding intervention.Immunohistochemistry staining was used to detect the proliferation of NSC in subventricular zone（SVZ）.After injection with Brdu，the rats were sacrificed 4 weeks after stimulation.Fluorescent double staining for Brdu/Neuronal nuclei antigen（Neun）and Brdu/Glial fibrillary acidic protein（GFAP）was performed in thebrain slices finally.Results In SVZ of rats，Brdu-positive cells began to increase 48 h after ischemia in the I/R group and the stimulation group.There were more Brdu positive cells in the stimulation group than the I/R group at 48 h（43.67±1.63，37.67±1.97；＜0.05）and 7 d（47.67±2.34，41.17±2.94；＜0.01）after ischemia/reperfusion in rats.Four weeks after stimulation，the Brdu-positive cells were significantly increased in cortex of the stimulation group（57.17±2.4）than I/R group（46.83±2.48）and sham-operation group（45.83 ±2.14）（＜0.01）.Fluorescence double staining showed that stimulation of OB had no effect on the differentiation of NSC into neurons or gliocytes（＞0.05）.Conclusions These observations demonstrated that electrical stimulation of OB might enhance proliferation of NSCin SVZ and promote migration of NSC to ischemic cortex，but OB stimulation has no effect on differentiation of NSC.

electrical stimulation；ischemia/reperfusion；neurogenesis，rats

R743.3；R33

：A

：1006-2963（2014）06-0414-05

2014-06-23）

（本文编辑：邹晨双）

10.3969/j.issn.1006-2963.2014.06.009

222002连云港市第一人民医院神经内科（张广慧、吴方荣、何明利、郭振委）；400016重庆医科大学附属第一医院神经内科（秦新月）

秦新月，Email：qinxy20011@sina.com