表面活性剂辅助提取首乌藤中的总黄酮

潘佳伟，闫 雨，尹 芹，杨小清，韩 伟，2

(1.华东理工大学 药学院 中药现代化工程中心，上海 200237;2.上海市新药设计重点实验室，上海 200237)

首乌藤，别名夜交藤，是蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥藤茎。其性甘微苦、平，具有祛风通络、养血安神等功效［1］，常用于治疗失眠多梦、血虚身痛、风湿痹痛等［2］多种病症。目前，对于首乌藤化学成分方面的研究主要集中于其中的蒽醌类［3］(如大黄素)、茋类［4］以及黄酮类成分。

黄酮类化合物是植物次生代谢产物，以游离态或与糖结合为苷的形式存在［5］。作为一种很强的抗氧化剂，它既能有效阻止细胞的退化、衰老，又可在一定程度上防止癌症的发生。此外，还具有降低血脂，抑制炎性生物酶的渗出，增进伤口愈合和止痛等药理作用［6］。首乌藤茎中的黄酮组分具有清除·OH和·O－2的能力［7］。

表面活性剂分子可增加大分子有机物质的溶解渗出能力［8］，目前已经被初步应用于天然产物的提取中。在中药提取中，加入合适、适量的表面活性剂，既可以实现水提操作、缩短浸润时间、提高提取效率，又能避免使用高成本的有机溶剂，减少重污染的发生［9］。

本文中笔者选取首乌藤为研究体系，采用表面活性剂辅助的方法提取首乌藤中的总黄酮，通过优化该方法的提取工艺，以期提高首乌藤中总黄酮的得率，为后续试验提供理论和数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要原料与试剂

首乌藤饮片(去叶)，上海华鹰药业有限公司(批号:HY2013060303，产地:安徽);芦丁对照品(批号:20130619)，上海金穗生物科技有限公司;NaNO2、NaOH和十二烷基硫酸钠(SDS)(化学纯)，上海凌峰化学试剂有限公司;Al(NO3)3(化学纯)，上海新宝精细化工厂;吐温-20、吐温-60、吐温-80和司班-60(化学纯)，国药集团化学试剂有限公司;去离子水，自制。

1.1.2 主要仪器设备

UV1900PC型紫外分光光度计，上海市亚研电子公司;JA31002型电子天平，上海市天平仪器厂;DF101-S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司;移液管、容量瓶、量筒等，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 供试品溶液的制备

取5.00 g首乌藤饮片置于500 mL圆底烧瓶中，按照一定的液固比加入相应体积的去离子水，并加入一定质量的表面活性剂，固定磁力搅拌功率，水浴加热至一定温度后，维持一定时间。结束后，静置冷却至常温，用纱布过滤，滤液作为供试品溶液待测。

1.2.2 分析方法

参考《中国药典》规定的黄酮含量分析方法［10］，以芦丁为标准品，用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法进行供试品溶液中总黄酮含量的测定。精密称取干燥至恒质量的芦丁对照品10 mg，置于50 mL容量瓶内，用体积分数30%的乙醇溶解并稀释至刻度，即得芦丁对照品溶液。将对照品溶液与供试品溶液置于紫外可见分光光度计下，于400～700nm的波长范围内进行扫描，确定首乌藤总黄酮的最大吸收波长为492 nm。然后精确吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0 mL 芦丁对照品溶液置于25 mL容量瓶中，顺序加入质量分数5%的NaNO2溶液1.0 mL(摇匀，放置6 min)、质量分数10%的Al(NO3)3溶液1.0 mL(摇匀，放置6 min)、质量分数10%的NaOH溶液10.0 mL，补加去离子水至刻度，摇匀，静置15 min后，以不含芦丁标准液为空白，在492 nm处测定吸光度(A492)。

以吸光度(A492)对总黄酮质量浓度(ρ)作回归处理得标准曲线方程A=13.025ρ+0.006 6，线性质量浓度范围为0.008～0.064 mg/mL;相关系数R2=0.999 1，表明具有良好的线性关系。通过系统稳定性实验，发现该分析方法精密度、重现性和显色稳定性均良好。

1.2.3 首乌藤中总黄酮含量的测定方法

取2.0 mL供试品溶液于25 mL容量瓶中，参照1.2.2在492 nm处测定吸光度，使用1.2.2中标准曲线方程计算得到总黄酮质量浓度，按照下式计算总黄酮得率。

式中:ρ为总黄酮质量浓度，mg/mL;V为溶剂量，mL;m为首乌藤的质量，g;n为溶液稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 提取工艺单因素的考察

2.1.1 表面活性剂种类对总黄酮得率的影响

常用表面活性剂分为离子型和非离子型，由于结构的不同，对于同一种物质的提取而言，效果也有差异。选取司班-60、SDS、吐温-20、吐温-60和吐温-80作为对象，考察表面活性剂种类对首乌藤中总黄酮得率的影响，结果如图1所示。

图1 表面活性剂对总黄酮得率的影响Fig.1 Effects of surfactant on the yield of total flavonoids

由图1可知:在表面活性剂质量浓度3 g/L、液固比20 mL/g、提取温度70℃、加热时间0.5 h的情况下，使用SDS作为表面活性剂提取得率最高，且SDS价格低廉，因而选择SDS作为实验所用的表面活性剂。

2.1.2 SDS质量浓度对总黄酮得率的影响

图2为考察不同的SDS质量浓度对首乌藤总黄酮得率的影响结果。

图2 SDS质量浓度对总黄酮得率的影响Fig.2 Effects of SDS concentration on the yield of total flavonoids

由图2可知:在液固比20 mL/g、提取温度70℃、加热时间0.5 h相同的情况下，在实验范围内，SDS质量浓度与得率存在正相关的关系。在较低质量浓度下，由于未达到临界胶束浓度，总黄酮得率随SDS质量浓度的增大而增加，达到临界胶束浓度后，SDS在饮片表面吸附达到极值，总黄酮得率提升不再显著，而过多的表面活性剂会造成浪费，故选择SDS的最佳质量浓度为3 g/L。

2.1.3 液固比对总黄酮得率的影响

对于传质而言，传质速率的大小与传质推动力的大小有关。图3为液固比对总黄酮得率的影响关系图。

由图3可以看出:在选定的实验范围内，随着液固比的升高，总黄酮得率逐渐上升，这是因为增加液固比能提高提取过程的传质推动力。当液固比超过30 mL/g后，由于溶剂量的增大，使得加热效果等因素受到干扰，总黄酮得率上升趋势不明显。同时，过高的液固比在实际的生产操作中会增加处理量和能耗，使生产效率降低。因此最终液固比为30 mL/g。

2.1.4 提取温度对总黄酮得率的影响

温度是微观粒子热运动的宏观表现，对提取效果存在影响。通过设置提取温度为65、70、75、80、85和90℃进行6组实验，考察提取温度对总黄酮得率的影响，结果见图4。

图3 液固比对总黄酮得率的影响Fig.3 Effects of liquid to solid ratio on the yield of total flavonoids

图4 提取温度对总黄酮得率的影响Fig.4 Effects of extracting temperature on the yield of total flavonoids

由图4可知:随着温度的升高，总黄酮得率呈上升趋势。在温度为75℃时，得率增长率较低，可能是在此温度下胶束结构达到平衡。温度突破75℃后，该平衡被打破，温度的升高会成为影响得率的显著因素，直至温度超过85℃再次达到平衡。综合能耗等因素，选取80℃为提取温度。

2.1.5 加热时间对总黄酮得率的影响

加热时间的长短将影响表面活性剂的提取效果。时间太短会使浸润、提取不完全，导致表面活性剂增溶效果减弱;而时间较长，不仅能耗增加，还会增加其他成分的溶出，增加后续纯化分离的成本。图5考察了不同加热时间对总黄酮得率的影响。

由图5可以看出:随着加热时间的延长，液固接触时间增多，有利于传质的进行，总黄酮得率上升。在2.5 h时，得率达到最大值。当加热时间超过2.5 h后黄酮得率呈现下降趋势，这可能是加热时间过长导致部分黄酮分解所致，因而加热时间选取2.5 h为宜。

图5 加热时间对总黄酮得率的影响Fig.5 Effects of heating time on the yield of total flavonoids

2.2 正交试验设计

在单因素试验结果分析的基础上，选取其主要影响因素进行正交试验设计。通过对试验结果的分析，确定首乌藤总黄酮的最佳提取工艺条件，并进行重现性验证。

以提取温度、加热时间、液固比为考察因素，每个因素考察3个水平，按照正交试验L9(33)表设计正交试验。因素水平表见表1，正交试验结果和分析表见表2和表3。

由表3的极差数据分析可见，各因素对首乌藤总黄酮得率的影响从大到小依次为:加热时间、提取温度、液固比。结合单因素试验与正交试验得到优化工艺条件得出:SDS质量浓度3 g/L，液固比40 mL/g，提取温度90℃，加热时间2.5 h。在此条件下，进行 3次平行实验，总黄酮得率平均值为6.1%。对比正交试验结果，可见该工艺结果较好，且具有较好的稳定性。

表1 正交试验的因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiments

表3 正交试验分析Table 3 Analysis of orthogonal experiments

2.3 对照实验结果

除本实验方法外，常用的中药提取方法包括:热回流提取法、超声协同提取法［11］、微波提取法［12］和索氏提取法。

笔者设计了对照实验，实验方案与结果见表4。其中，SDS辅助提取法(Ⅱ)采取最佳工艺条件进行;在实际工业生产中，一般考虑选取较小的液固比、药渣重复提取的方法，故将 SDS辅助提取法(Ⅰ)与最佳工艺进行对比，发现总黄酮得率相差不大，故确定以30 mL/g的液固比进行对比试验。

表4结果表明:表面活性剂辅助提取法得率最高，能显著提高首乌藤总黄酮的提取效率，避免高浓度有机溶剂的使用，更加绿色环保。因此，SDS辅助提取法在提高总黄酮得率方面有较大的优势，是较为理想的一种提取工艺。

表4 对比实验结果Table 4 Contrast experiment results

3 结论

采用表面活性剂辅助提取首乌藤中的总黄酮，考察了表面活性剂种类和浓度、提取温度、液固比、加热时间等因素对得率的影响，并通过正交试验设计优化工艺参数，结合对照实验，最终确定最优工艺条件:表面活性剂SDS质量浓度为3 g/L，液固比30 mL/g，提取温度90℃，加热时间2.5 h。

在最优工艺条件下，总黄酮得率为6%。该方法具有能耗低、时间短、得率高的特点。

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