新型柱前衍生试剂分析草甘膦的高效液相色谱研究

方 芳，魏荣卿，刘晓宁，李寿椿

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 211800;2.南京中意化工技术开发研究所，南京 210009)

草甘膦(glyphosate，PMG)，化学名称为 N-膦羧基甲基甘氨酸，是一种广谱、非选择性、内吸传导性强的除草剂［1］，它具有良好的除草性能，近年来在农业领域得到越来越多的应用。目前测定草甘膦的方法主要有分光光度法［2］、毛细管电泳(CE)［3］、离子色谱法［4］、气相色谱法(GC)［5］、液相色谱法(LC)等，而柱前衍生液相色谱法［6－8］是最常用的方法之一，柱前衍生液相色谱法中荧光衍生检测高效液相色谱法［9］、蒸发光散射检测高效液相色谱法［10］等所采用的仪器或试剂普及度较低，而紫外检测柱前衍生高效液相色谱法［6，11－12］则易于常规检测。用于紫外检测的柱前衍生化试剂有对甲氧基苯磺酰氯(MOBS-Cl)［6］、对甲基苯磺酰氯(TsCl)［11］、邻硝基苯磺酰氯(NBSC)［12］、对硝基苯甲酰氯(PNBC)［13］，3，5-二硝基-4-氯三氟甲苯(CNBF)［7］等，这些试剂存在反应温度高，或反应时间长，或反应后需萃取除去过量的试剂等缺点。针对以上缺点欲探索一种反应活性高、操作简单、衍生产物稳定的柱前衍生化试剂。

2，5-二甲氧基苯磺酰氯(DMOSC)常用于药物合成，但作为柱前衍生化试剂分析胺基化合物从未报道，本文采用DMOSC为新型柱前衍生化试剂，草甘膦为仲胺化合物代表，探索一种衍生反应条件温和、灵敏度高的高效液相检测草甘膦的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Summit型Dionex(戴安)高效液相色谱仪，色谱系统由P680 HPLC泵、UVD-170U可变波长紫外检测器、8125型进样装置和柱温箱TC-100组成。工作站:美国戴安Chromeleon公司。

DMOSC(98%，Alfa Aesar公司)，PMG标准品(99.2%，上海农药研究所);甲醇(HPLC级，Merck公司)，硼砂、Na2HPO4、无水乙醇均为市售分析纯;水为超纯水。

1.2 液相色谱条件

Kromasil C18 柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm);流动相:V(A甲醇)∶V(B乙腈)∶V(C磷酸盐缓冲溶液(0.02 mol/L，pH 5.5))=15∶5∶80;流速 1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长220 nm;进样量20 μL。

1.3 衍生方法

分别将PMG标样溶于硼砂缓冲溶液(0.2 mol/L，pH 10.0)中，配制 PMG 溶液(0.33 mg/mL)，DMOSC溶于甲醇配成溶液(5.54 mg/mL)，取前后两者体积比2∶1混合后，置于35℃恒温水浴中反应15 min，取出用0.45 μm滤膜过滤，按1.2液相条件检测。在 n(DMOSC)∶n(PMG)=6∶1、35 ℃、15 min、pH 10.0条件下进行衍生，化学反应式见图1。

1.4 标准曲线绘制

用硼砂缓冲溶液(0.2 mol/L，pH 10.0)配制PMG的储备液(100 μg/mL)，分别取储备液 0.05、0.15、0.25、0.35、0.45、0.55、0.65、0.75、0.90 和 1.0 mL 于10个试管，用缓冲溶液定容至1.0 mL(草甘膦质量浓度为5～100 μg/mL);DMOSC 10.2 mg溶于6 mL甲醇中，分别取0.5 mL于上述10个试管中，混合(1.5 mL/管)，按优化后的条件衍生并检测。

图1 2，5-二甲氧基苯磺酰氯与草甘膦化学反应式Fig.1 Reaction of 2，5-dimethoxybenzenesulfonyl chloride and glyphosate

2 结果与讨论

2.1 衍生化反应时间对衍生效率的影响

按衍生方法1.3考察衍生反应时间(1、5、10、20和30 min)对衍生效率的影响，反应10 min时的色谱图见图2。由图2可知:PMG与DMOSC很容易反应，反应速度很快，10 min已基本完成反应，相比于其他PMG衍生化反应［11］，该反应时间短，为保障反应完全，故确定15 min为最佳反应时间。

图2 草甘膦衍生反应液相色谱Fig.2 HPLC chromatogram of reaction solution

2.2 衍生化反应的温度对衍生效率的影响

在反应pH为9.0、反应时间为15 min时，考察不同反应温度(25、30、35、40、45 和50 ℃)对衍生效率的影响，结果见图3。由图3可知:随着反应温度的升高，衍生产物的量增加，35℃后衍生产物量随着温度的进一步升高反而减少。由此说明，DMOSC作为衍生化试剂相比于其他衍生试剂［6，11］表现为较低温度下的良好反应活性，这对于一些对温度敏感的生物活性物质的衍生化检测有重要的应用意义。取35℃为最佳反应温度。

图3 反应温度对衍生反应的影响Fig.3 Effects of reaction temperature on derivatization

2.3 衍生化反应的pH对衍生效率的影响

在反应温度35℃、反应15 min时，考察衍生不同反应pH(pH 8.0～11.0)对衍生反应效率的影响，结果见图4。

图4 pH对衍生反应的影响Fig.4 Effects of pH on derivatization

由图4可知:当pH较低时，反应释放的HCl会抑止反应;而当反应pH较高时，则易加快衍生试剂的水解，只有当pH 10.0至10.5时，此弱碱环境不仅可以中和衍生释放的HCl，且不易造成衍生试剂的水解，因此，选择pH=10.0为最佳pH。

2.4 衍生试剂的量对衍生效率的影响

通过改变衍生反应中添加的DMOSC的量来考察反应摩尔比对衍生效率的影响。结果表明:随着摩尔比的增加，衍生产物的量增加，同时衍生试剂的水解量明显增加，考虑既提高检测灵敏度，又避免大量衍生试剂水解浪费，选择衍生反应的摩尔比为1∶6。

2.5 精密度实验

相同条件下，平行反应5次，测定每次的峰面积，并求出其相对标准偏差(RSD)为0.98%，结果表明该方法有较好的重复性。

2.6 衍生反应液稳定性考察

将反应好的衍生产物溶液过滤，室温储存3个月后检测，结果显示衍生产物的峰形、峰面积、保留时间等无明显差异，表明衍生产物具有良好的稳定性。

2.7 标准曲线绘制及回收率实验

按1.4标准曲线绘制法结果表明PMG质量浓度在5～100 μg/mL范围内，PMG衍生产物峰面积与浓度呈良好的线性关系，回归方程为Y=Y=0.205 3x+1.427 8，R2=0.996 2，以信噪比 S/N=3计算检出限，其最小检出限为0.067 μg/mL。

将草甘膦标准样添加质量在空白水体中，添加质量浓度分别为45、65和75 μg/mL，然后衍生化，HPLC测定。所得水体中草甘膦的回收率分别为101.7、103.7和96.4%。由此可知该方法准确度很好，符合农药残留分析的要求。

3 结论

研究了新型的伯仲胺基衍生化试剂2，5-二甲氧基苯磺酰氯与仲胺草甘膦的柱前反应，用紫外-高效液相其衍生产物进行检测。通过一系列的衍生条件优化得知:该方法操作简单，反应时间短，反应条件温和，灵敏度高，在35℃下、15 min即可完成反应，而且衍生产物稳定，反应重复性好，HPLC色谱分离条件简单。综合考虑，该方法优于其他柱前衍生方法，同时相对于其他衍生剂来说，该试剂同样适用于其他含有胺基的生物活性物质的衍生化反应，是一种应用前景良好的衍生试剂。

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