木薯渣混菌发酵替代麸皮饲料的研究

杨 婷，廖美德，刘偲嘉，贺玉广，吴杰良

（华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室，广州 510642）

麸皮是小麦面粉厂的主要加工副产品，是重要的饲料原料[1]。用麸皮直接饲喂畜禽，其蛋白质的利用率不高，吸收率约为30%；膨化后饲喂，吸收率＞90%。麸皮水解液中含有五碳糖和六碳糖，能被酵母菌代谢利用，用此水解液培养酵母可获得优质饲料蛋白质[2]。但近年来小麦种植面积持续下降，麸皮价格不断上涨，成为制约其应用的重要因素[3]。

木薯渣不仅含有多种氨基酸和对动物体有益的维生素，而且产量丰富，价格低廉，作为新型饲料资源受到众多科研人员的重视，并取得一定的阶段性成果[4-7]。但木薯渣在饲料应用方面存在着不易贮存、蛋白质含量低和适口性差等弊端，限制其应用[8-9]。接种微生物，发酵木薯渣，利用微生物与相关化学物质发生的一系列复杂生物化学作用，可改变木薯渣的物理化学性质，从而解决上述弊端[10-11]。此外，发酵过程中还能杀死大部分有害微生物，如肠道寄生虫等。同时，还可以提高粗蛋白质和粗脂肪的消化率，促进与细胞壁结合的矿物质吸收；提高小肠绒毛的完整性，促进小肠对营养物质的吸收[12]。

本研究利用优良的黑曲霉和酿酒酵母复配制成混合菌剂，通过微生物固体发酵工艺，探索最佳生料发酵条件，提高木薯渣蛋白质含量，改善适口性，为木薯渣的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

木薯渣为广畜动物药业有限公司生产，产地为广西。

菌株来源：酿酒酵母和黑曲霉，由华南农业大学资源环境学院实验室保藏。

改良察氏培养基：土豆浸出液5%、蔗糖3%、硫酸镁0.5%、氯化钾0.05%、磷酸氢二钾0.1%、硝酸钠或硫酸铵0.4%。

酵母菌种子培养基1号：PDA液体培养基，一级种子培养基分装到试管，二级种子培养基分装到三角瓶。

酵母菌种子培养基2号：YPG液体培养基，含酵母浸粉0.5%、蛋白胨1.0%、葡萄糖2.0%，一级种子培养基分装到试管，二级种子培养基分装到三角瓶。

黑曲霉固体种子培养基：麸皮∶木薯渣∶水=1∶1∶1混合均匀。

所有培养基在“熟料”试验时，115℃下蒸汽灭菌30min，待冷却后备用；“生料”试验时，不做湿热灭菌处理，原料混合均匀即可接种。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母菌种子培养基筛选

选用PDA培养基和YPG培养基作为供试种子培养基，控制接种量均为一个单菌落，28℃下摇瓶培养24 h后，用血球计数板计算酵母菌细胞浓度。

1.2.2 氮源和不同初始水分选择

选取硝酸钠和硫酸铵作为供试氮源，添加量为0.4%，通过液体培养实验（氮源0.4%+酵母菌1.5%+YPG培养基）和固体培养实验[发酵底物为（木薯渣∶水=1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8）+氮源0.4%+酵母菌1.5%]，试验用同一规格三角瓶进行，混合均匀后置于28℃培养箱培养，定时观察生长情况并计数。

1.2.3 混菌发酵接种时间

木薯渣与水（70%）混合均匀后置于500mL三角瓶中，高压灭菌（115℃，20min）后备用。先加入黑曲霉孢子悬浮液（2.5%），再设置4组间隔时间（1组 0 h、2组 12 h、3组 24 h和4组36 h）加入酵母菌（2.5%），混合均匀后置于28℃培养箱培养，定时观察生长情况并计数。

1.2.4 氮源添加量的筛选

木薯渣培养基中硫酸铵的浓度共设置4个梯度（1组5%、2组10%、3组15%和4组20%），同时接入黑曲霉和酵母孢子悬浮液2.5%，混合均匀后置于28℃培养箱培养，定时观察生长情况并计数。

1.2.5 磷酸盐和糖蜜对木薯渣发酵的影响

设置两组对立试验，分别为添加磷酸盐（0.2%）或糖蜜（2%）组，对照组为不添加磷酸盐或糖蜜，其他培养条件不变，定时观察生长情况并计数。

1.2.6 黑曲霉固体种子的可行性

采取薄布包裹的扩大培养方式，定量称取培养好的黑曲霉固体种子（10%），混合均匀，其他培养条件不变，观察生长情况并计数。

2 结果与分析

2.1 酵母菌种子培养基

不同培养基对酵母菌生长的影响见图1。

图1 不同培养基对酵母菌生长的影响

由图1可知，YPG培养基中的酵母菌浓度比PDA培养基的高88%。同时，配制YPG时只需将3种试剂按比例添加混合均匀即可，操作比PDA的配制更为便捷，因此应选择YPG培养基作为酵母菌种子培养基。此外，酵母菌的对数生长期约在培养12 h时出现，24 h后其自溶现象比较明显，应在种子培养12～24 h内转接到下一级培养，保证种子的浓度和活力。

2.2 氮源的选择

2.2.1 液体培养实验

不同氮源对酵母菌生长的影响见图2。

图2 不同氮源对酵母菌生长的影响

采用改良察氏培养基，选取硝酸钠和硫酸铵作为供试氮源，添加量各为0.4%，28℃下摇瓶培养24 h，测定吸光度（OD600nm）。发现在液体培养试验中，添加硫酸铵组的OD值比添加硝酸钠的高，说明硫酸铵更能促进液体培养中酵母菌的生长。

2.2.2 固体培养实验

不同氮源在不同初始水分下对酵母菌生长的影响见图3。

图3 不同氮源在不同初始水分下对酵母菌生长的影响

由图3可知，以木薯渣为底物固体培养酵母菌，对比两种氮源对酵母菌生长的影响。其中，硝酸钠和硫酸铵的添加量均为3%，不同初始水分下培养48 h，血球板计数表明，不同水分梯度下两组的酵母菌浓度相当，差异不显著（P＞0.05）。因此，硝酸钠和硫酸铵在固体培养中对酵母菌生长无显著差异（P＞0.05）。

结果表明，虽然固体培养中氮源的影响差异不显著（P＞0.05），但硫酸铵在培养基中很快解离为NH4+和SO42-，其中NH4+能直接被酵母菌等微生物吸收利用，SO42-能降低培养基的pH，抑制细菌生长，并且硝酸钠的价格高于硫酸铵，所以硫酸铵更适宜作为木薯渣发酵的氮源。此外，从上述固体培养试验可知，原料水分为70%，经过48 h培养后，酵母菌细胞浓度最高。

2.3 混菌发酵接种时间

不同间隔时间接入酵母菌对酵母菌生长的影响见图4。

图4 不同间隔时间接入酵母菌对酵母菌生长的影响

黑曲霉能产淀粉酶，将木薯渣中的多糖分解为还原糖，能较好地为酵母菌利用，同时黑曲霉能产酸降低pH，正好也是适合酵母菌生长的pH范围。考虑到黑曲霉合成相关酶系需要时间，需探究延长接种酵母菌的必要性。混菌发酵，1组（0 h）、2组（12 h）、3组（24 h）、4组（36 h）分别表示在接入黑曲霉后，间隔0、12、24和36 h再接入酵母菌，培养期间，每12 h取样一次检测酵母菌细胞浓度。结果发现，同时接入黑曲霉和酵母菌的混菌发酵方式更有利于酵母菌生长，同时也能简化接种操作。

相对于单菌发酵，混菌发酵能促进酵母菌的生长，表现为酵母菌细胞浓度较前者提高约20%，原因在于黑曲霉能产生相关酶系，降解淀粉和粗纤维含量。但在本试验中也发现了另一问题，到培养后期时，各组酵母菌数量均有不同程度的下降。由于在三角瓶内培养，木薯渣培养基水分变化不大，对计数结果影响不大。其原因是黑曲霉在生长过程中逐渐生成孢子，抑制了酵母菌的生长。可适当调整两者的接种量，以最适接种比例发酵，同时在培养过程中，多翻动培养基，打断黑曲霉菌丝，延缓孢子生成。

2.4 氮源添加量

不同浓度的硫酸铵对酵母菌生长的影响见图5。

微生物生长需要充足的氮源。氮源的配比主要影响发酵底物对矿质的营养及其理化性质。但是氮源浓度过低，合成不了足量的营养物质；氮源浓度过高，即使不影响菌株生长，也会因产品中的残氮量过多降低养殖效果，并造成原料浪费。以硫酸铵为氮源，设置4个浓度梯度，即1组（5%）、2组（10%）、3组（15%）、4组（20%）。每隔12h测定酵母菌个数并观察其生长情况。结果发现，4组的酵母菌生长曲线均呈先上升、后下降、最后趋于稳定的趋势，拐点出现在36 h，此时黑曲霉菌丝生长旺盛。在培养后期，黑曲霉孢子的形成导致酵母菌数量下降后趋于平稳。

图5 不同浓度的硫酸铵对酵母菌生长的影响

总体而言，当硫酸铵的添加量为5%时，酵母菌生长情况最佳，同时黑曲霉长势也较好。考虑到最终发酵目的是使真蛋白质含量＞15%，原料中必须添加足够量的无机氮源。按硫酸铵含氮量为21.21%，蛋白质平均含氮量为16%计算，要达到这个指标，木薯渣培养基中至少添加硫酸铵13%。综合考虑，硫酸铵添加量最终定为15%。

2.5 磷酸盐

磷酸盐的添加对酵母菌生长的影响见图6。

图6 磷酸盐的添加对酵母菌生长的影响

磷酸盐提供金属离子的同时，又可以对发酵底物起缓冲作用，对pH的影响很大。因此，选取磷酸二氢钠作为供试磷酸盐，设置对比试验，即1组（无磷酸盐）和2组（磷酸盐0.5%），每隔24 h对酵母菌计数并观察生长情况。结果发现，磷酸盐的添加对酵母菌的生长影响不大，但能促进黑曲霉的生长。黑曲霉有更好的长势，意味着相关酶的产出会更多，能进一步改良木薯渣的性质，因此，发酵过程应添加磷酸二氢钠，添加量初步定为0.5%。

2.6 糖蜜

糖蜜对酵母菌生长的影响见图7。

图7 糖蜜对酵母菌生长的影响

糖蜜含有大量可发酵糖（主要是蔗糖），可用作酵母、味精、有机酸等发酵制品的底物或基料。试验设置两组，即1组（无糖蜜）、2组（糖蜜2%）每隔24 h对酵母菌计数并观察生长情况。结果发现，糖蜜在木薯渣混菌发酵中的作用是加快酵母菌生长速度但不增加其数量，同时对黑曲霉生长无显著的促进作用（P＞0.05）。

2.7 黑曲霉固体种子的可行性

接入黑曲霉固体种子对酵母菌生长的影响见图8。

图8 接入黑曲霉固体种子对酵母菌生长的影响

试验发现，接种黑曲霉液体种子比较难控制接种量。为保证黑曲霉种子在木薯渣发酵培养基中能保持活力，并便于控制其接种量，应探究接种固体黑曲霉固体种子的可行性。采取薄布包裹的扩大培养方式，定量称取黑曲霉固体种子。观察生长期并定时计数。试验发现，酵母菌的生长情况比在三角瓶中好，是因为扩大培养后通气量增加，有利于酵母菌有氧呼吸，促进其增殖。培养到48和60 h时出现肉眼可见的白色菌丝和黑色孢子，说明接种黑曲霉固体种子是可行的。

3 讨论

木薯渣发酵降解之后微生物含量和蛋白质含量增加，增加的蛋白质可能是淀粉酶和纤维素酶的一些细胞外分泌物，或者是细菌/真菌复合形成的单细胞蛋白质[13-14]。另外，降解可使氰化物含量下降，而营养成分（脂肪、粗纤维、灰分、矿物质）含量没有变化。为了能更好的降解木薯渣粗纤维含量，提高饲料蛋白质含量，还有很多条件可以更进一步优化。可尝试用产朊假丝酵母发酵，该菌种产蛋白质能力比较强[15]。实际生产中不便对原料灭菌，生料中的淀粉难以被酵母菌利用，配料时可用60℃的热水拌料，达到淀粉糊化的效果，增加培养基中单糖的含量，改变培养基营养成分，以利于酵母菌生长[16]。黑曲霉是一种食用安全，能够产生多种消化饲料的酶类，是常用的饲料复合酶产生菌，黑曲霉降解淀粉的能力比较强，但因其产黑色孢子，影响发酵产物外观，而糖化酶对木薯渣的淀粉降解率为74.87%，可选择工业糖化酶替代黑曲霉[17]。米曲霉的效果比黑曲霉要好，而且米曲霉所产的孢子偏黄绿色，对发酵产物外观影响不大[18]。即可考虑采用“工业糖化酶+酵母菌+米曲霉”的混合培养方式发酵木薯渣。因此，为了不同需求可更进一步优化发酵工艺，以便将木薯渣的利用价值发挥到最大。

4 结论

本试验对采用酿酒酵母菌和黑曲霉作为发酵菌株，对开发木薯渣发酵饲料进行了初步探究，主要内容为探讨其发酵工艺条件，确定酵母菌以液体形式接入，其种子采用液体YPG培养基培养，12～24 h后转接到下一级培养；黑曲霉以固体形式接入，其种子采用麸皮-木薯渣复合培养基培养。生料发酵工艺条件为硫酸铵15%、磷酸二氢钠0.5%、底物水分70%，同时接入酵母菌和黑曲霉，接种量均为10%。24～48 h酵母菌即能到达最高生长浓度，且黑曲霉此后在60～72 h生成较多肉眼可见的黑色孢子，导致培养基整体发黑，影响其外观，不利于做成饲料成品，因此将培养周期定为60 h。混菌发酵过程应及时翻动培养基，目的在于打断菌丝以延缓黑曲霉孢子生成。

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