甘蓝型油菜叶片组织培养体系的优化

申静静++廖玉才++李和平

摘要：以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）叶片为材料，分析了影响油菜叶片离体培养的关键因素——基因型、基本培养基、激素配比及外植体取材时间，优化了油菜叶片组织培养体系。结果表明，

关键词：油菜（Brassica napus L.）；叶片；组织培养

中图分类号：S565.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）02-0447-03

The Optimization of Regeneration System of Rapeseed（Brassica napus L.） Leaf

SHEN Jing-jinga，LIAO Yu-caib，LI He-pinga

（a.Moleculer Biotechnology Laboratory of Triticeae Crops/College of Life Science and Technology； b.Moleculer Biotechnology Laboratory of Triticeae Crops/College of Plant Science and Technology， Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070， China）

Abstract： Using leaf as explants from Brassica napus and focusing on factors（genotype， basic media， the hormones combinations and seeding age of explants） affecting the leaves regeneration in vitro， an effective regeneration system was established. The results showed that MS+4 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA was best for shooting， with differentiation and regeneration rate of 75.2% and 28.1%， respectively 1/2 MS+1 mg/L IBA was best for rooting， with the rooting rate of 100%. The explants of different seeding age from the same genotype showed great difference of shooting differentiation and regeneration capability. The 22-day leaf of F4 cultivar was the best explant for tissue culture.

Key words： Brassica napus L.； leaf； tissue culture

油菜（Brassica napus L.）是我国主要的油料作物之一[1]。近年来，随着高等植物转基因技术的不断发展和应用，油菜高频率植株再生组织培养体系是进行外源基因遗传转化的基础，因此，探讨油菜离体培养中不定芽分化和成苗的影响因素具有重要意义。自1974年Kartha等[2]首次从甘蓝型油菜的茎切段组织培养诱导分化获得植株以来，花序轴[3]、带柄子叶[4，5]、下胚轴[6，7]、叶片[8-10]和子叶[11，12]等外植体被成功应用于油菜离体诱导获得再生植株。本研究主要以F4和T15油菜品系的子叶为外植体，筛选合适于组织培养的基因型；以F4第18、22天苗龄的叶片为外植体，进一步优化了分化和生根培养基，建立了甘蓝型油菜F4品系叶片的再生体系，为通过油菜叶绿体转基因技术获得优良性状的甘蓝型油菜奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

油菜F4和T15品系由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。

1.2 培养基

1.3 方法

1.3.1 种子的消毒与无菌苗的获得 挑选种皮完好、饱满的油菜种子，70%乙醇消毒2 min，无菌水冲洗1次，15% H2O2灭菌35 min，无菌水冲洗3次。将种子置于B5基本培养基中培养2 d。挑选长势一致的健壮幼苗移至B5基本培养基中继续生长。培养温度25 ℃，光照强度为2 000 lx，16 h/8 h（光照/黑暗）。

1.3.2 愈伤组织的诱导及分化 挑选5～6 d的子叶，将子叶切成3 mm×3 mm大小，置于愈伤诱导培养基中。诱导培养8周后，转分化培养，每2周继代一次。诱导培养2 周时统计愈伤诱导率，分化培养4～6周时进行分化率和成苗率统计，试验设3个重复。愈伤诱导率=产生愈伤组织的外植体数/接种的总外植体数×100%；分化率=至少分化出一个根或芽的外植体数/接种的总外植体数×100%；成苗率=至少出现一株苗的外植体数/接种的总外植体数×100%。

1.3.3 不同分化培养基对外植体芽、苗分化的影响 取苗龄18、22 d的叶片作为外植体，将叶片切成3 mm×3 mm大小，愈伤诱导培养基均为A，愈伤组织接种到不同分化培养基上。每2周继代一次，分化培养4～6周时进行统计分化率，试验设3个重复。试验设有A与B①、A与B②、A与B③、A与B④、A与B⑤、A与B⑥、A与B⑦、A与B⑧、A与B⑨等处理。数据采用Excel和SAS软件处理，对分化率和成苗率统计结果进行方差分析。

1.3.4 生根培养基对外植体生根的影响 待芽、苗生长到2～3 cm时，去掉多余的愈伤组织移至生根培养基中，培养14 d后统计生根率。生根率=生根苗数/接种苗数×100%。

2 结果与分析

2.1 基因型对油菜组织培养的影响

对F4和T15子叶进行相同条件下的愈伤诱导和愈伤分化培养，2周时统计愈伤诱导率，4～6周时统计分化率和成苗率。由表1可知，F4子叶诱导率和成苗率均高于T15；T15的分化率高于F4，但成苗率低于F4，F4具有较好的组织培养特性，可作为后继研究的外植体供试品系。

2.2 不同培养基对油菜叶片愈伤组织分化的影响

F4第18、22天叶片的愈伤组织进行不同分化培养基的分化培养。本研究没有对愈伤诱导培养进行优化，而是针对分化率和成苗率进行筛选培养。由表2可知， 分化培养基B⑧与其他分化培养基分化效率进行差异显著性分析，结果显示苗龄18 d和22 d的叶片的分化率、成苗率均存在显著性差异（P<0.05），B⑧分化效果最佳，芽、苗分化状态好，玻璃化现象少； B⑧分化培养基下，F4第22天叶片分化效率最高达到75.2%，成苗率可达28.1%； 18 d和22 d叶片在B⑧分化培养基上最高成苗率分别为25.4%和28.1%，第22天叶片更适合组织培养。

2.3 不同培养基对油菜愈伤组织生根诱导的影响

将由F4第22天叶片分化的芽置于生根培养基上，培养至14 d时统计生根情况结果见表3、图1。由表3可知，在1/2 MS中添加1 mg/L IBA 的C④生根培养基中，生根率可达100%，生根较快，诱导的不定根也较多、较粗壮。不同的生根诱导培养基对幼苗和不定根的伸长也有较大的影响，C①和C⑤几乎不生根，C③和C④都能有效诱导生根，但C④效果明显好于C③，生根较快、较粗壮，C③蔗糖比例大于C④，可能在生根阶段，降低蔗糖浓度，有利于生根诱导。

3 小结与讨论

不同品系的同一类型外植体的愈伤组织诱导率和不定芽分化率均存在显著差异（P<0.05），F4品系子叶诱导率可达98.3%，18 d和22 d叶片的诱导率为98.0%和98.6%，T15愈伤诱导率均低于这个水平，F4组织培养特性优于T15。

本研究表明，4 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA搭配诱导芽苗分化的效果最佳，这与已往在芸薹属中，能分化出再生植株的培养基大多采用6-BA和NAA组合[14-16]的结果相似。6-BA浓度为4 mg/L时，芽分化多且很少出现苗玻璃化现象；高浓度6-BA导致“玻璃化”现象严重；浓度低时，芽分化率低。1/2 MS基本培养基中添加1 mg/L IBA时，其生根效果最好。不同的基本培养基对生根效率和长势也存在较大影响，添加相同浓度和种类的激素，MS比B5培养基生根效果较好，MS基本培养基更适合于生根培养。不同苗龄的叶片直接影响愈伤的诱导率和分化率。对F4品系12、15、18和22 d苗龄的叶片进行再生试验，结果表明，22 d的叶片愈伤诱导率和分化率最高。这样取材时间比Hou等[5]、韩善华等[13]的缩短将近一半，不但节省了外植体的取材时间，而且可以获得更高的成苗率。

参考文献：

[1] 刘国红，梁明祥，周诗雨，等.甘蓝型油菜南盐油1号不同外植体体系的比较研究[J].南京农业大学学报，2012，35（3）：42-46.

[2] KARTHA K K， GAMBORG O L， CONSTABEL F. In vitro plant formation from stem explants of rape（Brassica napus cv. Zephyr） [J]. Physiol，1974，31（3）：217-220.

[3] 韩德俊，曹 莉，袁本威，等.甘蓝型油菜花茎高效再生体系研究[J].农业生物技术科学，2005，12（6）：86-88.

[4] 王 艳，贺 宾，曾幼玲，等.甘蓝型油菜带柄子叶的高频植株的研究[J].中国油料作物学报，2004，26（4）：86-90.

[5] HOU B K， ZHOU Y H， WAN L H， et al. Chloroplast transformation in oilseed rape[J]. Transgenic Research，2003，12（1）：111-114.

[6] 王俊生，范小芳，谭光轩，等.甘蓝型黄籽油菜高油品系下胚轴体系的研究[J].河南农业科学，2012，41（1）：45-48.

[7] MUHAMMAD R K， HAMID R， MUHAMMAD A， et al. High frequency shoot regeneration and Agrobacterium-mediated DNA transfer in Canola （Brassica napus）[J].Plant Cell，2003，75（3）：223-231.

[8] YOKO A K， HIDEFUMI Y， YOSHIHITO T. Efficient plant regeneration from leaves of rapeseed（Brassica napus L.）： The influence of AgNO3 and genotype[J]. Plant Cell Rep，2005，24（11）：649-654.

[9] 王艾平，赵 红，林国卫，等.植物生长调节剂对甘蓝型油菜愈伤组织诱导和生长的影响[J].山西农业科学，2011，39（8）：797-799.

[10] 周吉源，程井辰，王家训.油菜花序轴、叶片组织培养中形态发生的细胞组织学研究[J].武汉植物学研究，1988，6（1）：45-49.

[11] 潘 刚，石淑稳，魏泽兰，等.甘蓝型冬性和半冬性油菜子叶高效快速芽体系的建立[J].华中农业大学学报，2004，26（3）：1-5.

[12] CHENG L， LI H P， QU B， et al. Chloroplast transformation of rapeseed（Brassica napus） by particle bombardment of cotyledons[J]. Plant Cell Rep，2010，29（4）：371-381.

[13] 韩善华，郑国锠.油菜（Brassica napus L.） 叶片植株的再生[J]. 实验生物学报，1983，16（1）：1-7.

[14] 王景雪，孙 毅.芸薹属（Brassica）植物的组织培养和基因转化[J].山西农业大学学报，1996，16（3）：9-14.

[15] 王景雪， 孙 毅， 崔贵梅，等.在油菜组织培养中激素及基因型对下胚轴分化的影响[J].中国油料作物学报，2000，22（1）：11-14.

[16] 石淑稳，周永明.甘蓝型油菜下胚轴培养和高频率芽再生技术的研究[J].中国油料作物学报，1998，20（2）：1-6.

2 结果与分析

2.1 基因型对油菜组织培养的影响

对F4和T15子叶进行相同条件下的愈伤诱导和愈伤分化培养，2周时统计愈伤诱导率，4～6周时统计分化率和成苗率。由表1可知，F4子叶诱导率和成苗率均高于T15；T15的分化率高于F4，但成苗率低于F4，F4具有较好的组织培养特性，可作为后继研究的外植体供试品系。

2.2 不同培养基对油菜叶片愈伤组织分化的影响

F4第18、22天叶片的愈伤组织进行不同分化培养基的分化培养。本研究没有对愈伤诱导培养进行优化，而是针对分化率和成苗率进行筛选培养。由表2可知， 分化培养基B⑧与其他分化培养基分化效率进行差异显著性分析，结果显示苗龄18 d和22 d的叶片的分化率、成苗率均存在显著性差异（P<0.05），B⑧分化效果最佳，芽、苗分化状态好，玻璃化现象少； B⑧分化培养基下，F4第22天叶片分化效率最高达到75.2%，成苗率可达28.1%； 18 d和22 d叶片在B⑧分化培养基上最高成苗率分别为25.4%和28.1%，第22天叶片更适合组织培养。

2.3 不同培养基对油菜愈伤组织生根诱导的影响

将由F4第22天叶片分化的芽置于生根培养基上，培养至14 d时统计生根情况结果见表3、图1。由表3可知，在1/2 MS中添加1 mg/L IBA 的C④生根培养基中，生根率可达100%，生根较快，诱导的不定根也较多、较粗壮。不同的生根诱导培养基对幼苗和不定根的伸长也有较大的影响，C①和C⑤几乎不生根，C③和C④都能有效诱导生根，但C④效果明显好于C③，生根较快、较粗壮，C③蔗糖比例大于C④，可能在生根阶段，降低蔗糖浓度，有利于生根诱导。

3 小结与讨论

不同品系的同一类型外植体的愈伤组织诱导率和不定芽分化率均存在显著差异（P<0.05），F4品系子叶诱导率可达98.3%，18 d和22 d叶片的诱导率为98.0%和98.6%，T15愈伤诱导率均低于这个水平，F4组织培养特性优于T15。

本研究表明，4 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA搭配诱导芽苗分化的效果最佳，这与已往在芸薹属中，能分化出再生植株的培养基大多采用6-BA和NAA组合[14-16]的结果相似。6-BA浓度为4 mg/L时，芽分化多且很少出现苗玻璃化现象；高浓度6-BA导致“玻璃化”现象严重；浓度低时，芽分化率低。1/2 MS基本培养基中添加1 mg/L IBA时，其生根效果最好。不同的基本培养基对生根效率和长势也存在较大影响，添加相同浓度和种类的激素，MS比B5培养基生根效果较好，MS基本培养基更适合于生根培养。不同苗龄的叶片直接影响愈伤的诱导率和分化率。对F4品系12、15、18和22 d苗龄的叶片进行再生试验，结果表明，22 d的叶片愈伤诱导率和分化率最高。这样取材时间比Hou等[5]、韩善华等[13]的缩短将近一半，不但节省了外植体的取材时间，而且可以获得更高的成苗率。

参考文献：

[1] 刘国红，梁明祥，周诗雨，等.甘蓝型油菜南盐油1号不同外植体体系的比较研究[J].南京农业大学学报，2012，35（3）：42-46.

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[4] 王 艳，贺 宾，曾幼玲，等.甘蓝型油菜带柄子叶的高频植株的研究[J].中国油料作物学报，2004，26（4）：86-90.

[5] HOU B K， ZHOU Y H， WAN L H， et al. Chloroplast transformation in oilseed rape[J]. Transgenic Research，2003，12（1）：111-114.

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[8] YOKO A K， HIDEFUMI Y， YOSHIHITO T. Efficient plant regeneration from leaves of rapeseed（Brassica napus L.）： The influence of AgNO3 and genotype[J]. Plant Cell Rep，2005，24（11）：649-654.

[9] 王艾平，赵 红，林国卫，等.植物生长调节剂对甘蓝型油菜愈伤组织诱导和生长的影响[J].山西农业科学，2011，39（8）：797-799.

[10] 周吉源，程井辰，王家训.油菜花序轴、叶片组织培养中形态发生的细胞组织学研究[J].武汉植物学研究，1988，6（1）：45-49.

[11] 潘 刚，石淑稳，魏泽兰，等.甘蓝型冬性和半冬性油菜子叶高效快速芽体系的建立[J].华中农业大学学报，2004，26（3）：1-5.

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[13] 韩善华，郑国锠.油菜（Brassica napus L.） 叶片植株的再生[J]. 实验生物学报，1983，16（1）：1-7.

[14] 王景雪，孙 毅.芸薹属（Brassica）植物的组织培养和基因转化[J].山西农业大学学报，1996，16（3）：9-14.

[15] 王景雪， 孙 毅， 崔贵梅，等.在油菜组织培养中激素及基因型对下胚轴分化的影响[J].中国油料作物学报，2000，22（1）：11-14.

[16] 石淑稳，周永明.甘蓝型油菜下胚轴培养和高频率芽再生技术的研究[J].中国油料作物学报，1998，20（2）：1-6.

2 结果与分析

2.1 基因型对油菜组织培养的影响

对F4和T15子叶进行相同条件下的愈伤诱导和愈伤分化培养，2周时统计愈伤诱导率，4～6周时统计分化率和成苗率。由表1可知，F4子叶诱导率和成苗率均高于T15；T15的分化率高于F4，但成苗率低于F4，F4具有较好的组织培养特性，可作为后继研究的外植体供试品系。

2.2 不同培养基对油菜叶片愈伤组织分化的影响

F4第18、22天叶片的愈伤组织进行不同分化培养基的分化培养。本研究没有对愈伤诱导培养进行优化，而是针对分化率和成苗率进行筛选培养。由表2可知， 分化培养基B⑧与其他分化培养基分化效率进行差异显著性分析，结果显示苗龄18 d和22 d的叶片的分化率、成苗率均存在显著性差异（P<0.05），B⑧分化效果最佳，芽、苗分化状态好，玻璃化现象少； B⑧分化培养基下，F4第22天叶片分化效率最高达到75.2%，成苗率可达28.1%； 18 d和22 d叶片在B⑧分化培养基上最高成苗率分别为25.4%和28.1%，第22天叶片更适合组织培养。

2.3 不同培养基对油菜愈伤组织生根诱导的影响

将由F4第22天叶片分化的芽置于生根培养基上，培养至14 d时统计生根情况结果见表3、图1。由表3可知，在1/2 MS中添加1 mg/L IBA 的C④生根培养基中，生根率可达100%，生根较快，诱导的不定根也较多、较粗壮。不同的生根诱导培养基对幼苗和不定根的伸长也有较大的影响，C①和C⑤几乎不生根，C③和C④都能有效诱导生根，但C④效果明显好于C③，生根较快、较粗壮，C③蔗糖比例大于C④，可能在生根阶段，降低蔗糖浓度，有利于生根诱导。

3 小结与讨论

不同品系的同一类型外植体的愈伤组织诱导率和不定芽分化率均存在显著差异（P<0.05），F4品系子叶诱导率可达98.3%，18 d和22 d叶片的诱导率为98.0%和98.6%，T15愈伤诱导率均低于这个水平，F4组织培养特性优于T15。

本研究表明，4 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA搭配诱导芽苗分化的效果最佳，这与已往在芸薹属中，能分化出再生植株的培养基大多采用6-BA和NAA组合[14-16]的结果相似。6-BA浓度为4 mg/L时，芽分化多且很少出现苗玻璃化现象；高浓度6-BA导致“玻璃化”现象严重；浓度低时，芽分化率低。1/2 MS基本培养基中添加1 mg/L IBA时，其生根效果最好。不同的基本培养基对生根效率和长势也存在较大影响，添加相同浓度和种类的激素，MS比B5培养基生根效果较好，MS基本培养基更适合于生根培养。不同苗龄的叶片直接影响愈伤的诱导率和分化率。对F4品系12、15、18和22 d苗龄的叶片进行再生试验，结果表明，22 d的叶片愈伤诱导率和分化率最高。这样取材时间比Hou等[5]、韩善华等[13]的缩短将近一半，不但节省了外植体的取材时间，而且可以获得更高的成苗率。

参考文献：

[1] 刘国红，梁明祥，周诗雨，等.甘蓝型油菜南盐油1号不同外植体体系的比较研究[J].南京农业大学学报，2012，35（3）：42-46.

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[7] MUHAMMAD R K， HAMID R， MUHAMMAD A， et al. High frequency shoot regeneration and Agrobacterium-mediated DNA transfer in Canola （Brassica napus）[J].Plant Cell，2003，75（3）：223-231.

[8] YOKO A K， HIDEFUMI Y， YOSHIHITO T. Efficient plant regeneration from leaves of rapeseed（Brassica napus L.）： The influence of AgNO3 and genotype[J]. Plant Cell Rep，2005，24（11）：649-654.

[9] 王艾平，赵 红，林国卫，等.植物生长调节剂对甘蓝型油菜愈伤组织诱导和生长的影响[J].山西农业科学，2011，39（8）：797-799.

[10] 周吉源，程井辰，王家训.油菜花序轴、叶片组织培养中形态发生的细胞组织学研究[J].武汉植物学研究，1988，6（1）：45-49.

[11] 潘 刚，石淑稳，魏泽兰，等.甘蓝型冬性和半冬性油菜子叶高效快速芽体系的建立[J].华中农业大学学报，2004，26（3）：1-5.

[12] CHENG L， LI H P， QU B， et al. Chloroplast transformation of rapeseed（Brassica napus） by particle bombardment of cotyledons[J]. Plant Cell Rep，2010，29（4）：371-381.

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[16] 石淑稳，周永明.甘蓝型油菜下胚轴培养和高频率芽再生技术的研究[J].中国油料作物学报，1998，20（2）：1-6.