酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的响应面优化提取

梁巧荣等

摘要：以优化提取率为目标，采用响应面法考察液料比、乙酸浓度、时间和温度4因素对酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白提取率的影响。结果表明，乙酸浓度、时间、温度对提取率的影响显著，最佳提取条件为液料比30∶1、乙酸浓度1.2 mol/L，时间6.2 h，温度63 ℃，此条件下得到的提取率为9.88%。

关键词：罗非鱼鳞；胶原蛋白；响应面法

中图分类号：TS254.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）02-0395-03

Optimizing the Extraction of Acid Soluble Tilapia Scale Collagen by

Response Surface Methodology

LIANG Qiao-rong，JI Ying-jun，LIU Yong，WEI Shou-lian

（School of Chemical and Engineering， Zhaoqing University， Zhaoqing 526061， Guangdong，China）

Abstract： Using extraction rate as target the extraction of the acid soluble tilapia scale collagen was optimized by response surface method on four factors including ratio of liquid to solid， acetic acid concentration， time and temperature. The results showed that the acetic acid concentration， time and temperature had significant influence on the extraction rate. The best extraction rate was 9.88% when it is at 63 ℃ for 6.2 hours with liquid to solid ratio of 30∶1 and acetic acid concentration of 1.2 mol/L.

Key words： tilapia scales； collagen； response surface methodology

肇庆市是广东省罗非鱼重点产区和出口重要基地，主要以冷冻鱼片形式出口欧美。在鱼片加工过程中会产生大量鱼鳞等下脚料，这些下脚料一般用作动物饲料，深加工利用程度很低，这样不但浪费宝贵的蛋白资源，而且还可能造成环境污染。

鱼鳞约占鱼体重5%，含有丰富胶原蛋白。胶原蛋白具有良好的生物相容性、生物降解性和低免疫排斥性，被广泛应用于日用化工、食品、医药、化妆品等领域[1-3]。胶原蛋白基生物医用材料在人造皮肤、人造血管、药物载体、创伤修复等领域的应用受到广泛关注[1，4]，在全球每年销售额已超过40亿美元。因此，开发新的胶原蛋白资源特别是鱼类胶原蛋白受到重点关注[5，6]。本研究对酸溶性鱼鳞胶原蛋白的提取工艺进行响应面优化，建立提取工艺模型，探索最佳提取条件，以期为进一步开发利用鱼鳞胶原蛋白提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼鳞由恒兴水产公司提供；乙酸、高氯酸、羟脯氨酸、氯胺T、对二甲基氨基苯甲醛、乙二醇甲醚等试剂均为分析纯。

TD3C800B型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），DFY-250A型高速组织粉碎机（上海比朗仪器有限公司），754型紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 酸溶性鱼鳞胶原蛋白制备工艺 罗非鱼鳞→清洗干净→脱脂除钙→干燥→粉碎→悬浮液→酸提→离心→上清液→透析→干燥→酸溶性胶原蛋白。

1.2.2 酸溶性鱼鳞胶原蛋白提取率的测定 将除杂鱼鳞粉与一定浓度的乙酸溶液配成悬浮液，在一定温度下恒温酸提一段时间后，离心，取上清液参照文献[7，8]的方法测定其羟脯氨酸含量。以羟脯氨酸为标准品，其标准曲线的回归方程为Y=0.347 3X-0.012 67 （R2=0.998 8）。酸溶性鱼鳞胶原蛋白提取率按下式计算：

式中，m为除杂鱼鳞粉的质量，g；C为提取液羟脯氨酸的浓度，g/mL；V为提取液的体积，mL。

1.2.3 响应面试验设计 根据单因素试验的结果和中心复合设计原理，以提取率为优化目标，选择液料比、乙酸浓度、时间、温度进行4因素3水平响应面试验。试验因素水平编码表见表1。

2 结果与分析

2.1 响应面试验结果分析

响应面试验设计与试验结果见表2。采用Design-Expert软件对试验数据进行分析，得到提取率与液料比、乙酸浓度、时间、温度的回归方程（实际值）为：

2，说明回归方程极显著，试验误差小。另外，失拟项P值为0.371 7，差异不显著，说明该回归方程能较好地描述酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的提取。

由表4可知，乙酸浓度、时间、温度对酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白提取率的影响显著。各因素对提取率影响大小顺序为乙酸浓度、温度、时间、液料比。另外，AD、BC、B2、C2、D2对提取率的影响显著。

2.2 响应面分析

液料比、乙酸浓度、时间与温度对酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白提取率影响的响应曲面与等高线见图1。从图1可知，因素乙酸浓度的曲面比较陡，轴向等高线比较密，说明乙酸浓度对提取率的影响最显著；而液料比的曲面平缓，轴向等高线在试验范围内没有观察到，表明液料比对提取率的影响最不显著。另外，从图1中各图等高线的形状还可知，因素B与C交互作用显著，B与D、C与D有一定的交互作用；A与D的等高线形状和曲面为鞍形，交互作用显著。

2.3 最佳提取工艺的确定与试验验证

由Design-Expert得到酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的最佳提取条件为：液料比30∶1、乙酸浓度1.2 mol/L，时间6.2 h、温度62.6 ℃，提取率的预测值为10.17%。根据试验情况，确定最佳提取条件为：液料比30∶1、乙酸浓度1.2 mol/L、时间6.2 h、温度63 ℃。在此条件下进行平行试验3次，得到提取率平均值为9.88%，相对误差为2.85%。结果表明该回归方程用于分析酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的提取是可靠的。

3 小结与讨论

采用响应面法对酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的提取进行了优化。因素乙酸浓度、时间、温度对酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白提取率的影响显著，各因素对提取率的影响大小为乙酸浓度、温度、时间、液料比。最佳提取条件为液料比30∶1、乙酸浓度1.2 mol/L、时间6.2 h、温度63 ℃，此条件下的提取率为9.88%，与预测值相比无显著差异。

参考文献：

[1] 刘 永，崔英德，尹国强，等.组织工程用蛋白基水凝胶[J].材料导报，2008，22（8）：25-28.

[2] ROCHE S， RONZIERE M C， HERBANGE D， et al. Native and DPPA cross-linked collagen sponges seeded with fetal bovine epiphyseal chondrocytes used for cartilage tissue engineering[J]. Biomaterials，2006，22（1）：9-18.

[3] 吴 波，陈运中.鱼鳞胶原蛋白的研究进展及应用[J].武汉工业学院学报，2007，26（4）：29-32.

[4] 汪海波，汪海婴，梁艳萍，等.草鱼鱼鳞胶原蛋白的凝胶性能研究[J].功能材料，2012，43（4）：433-441.

[5] SANKAR S， SEKAR S， MOHAN R， et al. Preparation and partial characterization of collagen sheet from fish scales[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2008，42（1）：6-9.

[6] SAITO M， TAKENOUCHI Y，KUNISAKI N，et al. Complete primary structure of rainbow trout type I collagen consisting of α1（I） α2（I） α3（I） heterotrimers[J]. European Journal of Biochemistry，2006，268（10）：2817-2827.

[7] 张俊杰，曾庆孝.比色法测定鱼鳞中羟脯氨酸的研究[J].食品科技，2004（4）：83-85.

[8] 郭恒斌，曾庆祝，闫 磊，等.分光光度法测定鱼皮中羟脯氨酸含量[J].现代食品科技，2007，23（7）：81-83.

2.3 最佳提取工艺的确定与试验验证

由Design-Expert得到酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的最佳提取条件为：液料比30∶1、乙酸浓度1.2 mol/L，时间6.2 h、温度62.6 ℃，提取率的预测值为10.17%。根据试验情况，确定最佳提取条件为：液料比30∶1、乙酸浓度1.2 mol/L、时间6.2 h、温度63 ℃。在此条件下进行平行试验3次，得到提取率平均值为9.88%，相对误差为2.85%。结果表明该回归方程用于分析酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的提取是可靠的。

3 小结与讨论

采用响应面法对酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的提取进行了优化。因素乙酸浓度、时间、温度对酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白提取率的影响显著，各因素对提取率的影响大小为乙酸浓度、温度、时间、液料比。最佳提取条件为液料比30∶1、乙酸浓度1.2 mol/L、时间6.2 h、温度63 ℃，此条件下的提取率为9.88%，与预测值相比无显著差异。

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2.3 最佳提取工艺的确定与试验验证

由Design-Expert得到酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的最佳提取条件为：液料比30∶1、乙酸浓度1.2 mol/L，时间6.2 h、温度62.6 ℃，提取率的预测值为10.17%。根据试验情况，确定最佳提取条件为：液料比30∶1、乙酸浓度1.2 mol/L、时间6.2 h、温度63 ℃。在此条件下进行平行试验3次，得到提取率平均值为9.88%，相对误差为2.85%。结果表明该回归方程用于分析酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的提取是可靠的。

3 小结与讨论

采用响应面法对酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白的提取进行了优化。因素乙酸浓度、时间、温度对酸溶性罗非鱼鳞胶原蛋白提取率的影响显著，各因素对提取率的影响大小为乙酸浓度、温度、时间、液料比。最佳提取条件为液料比30∶1、乙酸浓度1.2 mol/L、时间6.2 h、温度63 ℃，此条件下的提取率为9.88%，与预测值相比无显著差异。

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[8] 郭恒斌，曾庆祝，闫 磊，等.分光光度法测定鱼皮中羟脯氨酸含量[J].现代食品科技，2007，23（7）：81-83.