番茄叶中总黄酮提取工艺及含量测定的研究

杜成智

摘要：为了优化番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）叶总黄酮含量的最佳提取工艺并测定其总黄酮的含量。以总黄酮含量为考察指标，采用正交设计的方法研究提取番茄叶总黄酮的工艺条件，并测定其总黄酮含量。结果表明，影响番茄叶总黄酮提取的主次因素依次为甲醇浓度、溶剂量、超声时间、浸泡时间；建立了番茄叶总黄酮含量的测定方法。其总黄酮的最佳提取工艺为100%甲醇20 mL，浸泡30 min，超声30 min；总黄酮的含量测定方法简便可靠。

关键词：番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）叶；总黄酮；含量测定；紫外-可见分光光度法；正交设计

中图分类号：O623.54 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）02-0392-03

Extraction and Content Determination of Total Flavonoids from Leaves of

Lycopersicon esculentum Mill.

DU Cheng-zhi1，WANG Hui1，FENG Xu1，LI Yin1，MEN Yan-fei2

（1.Faculty of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001，China；

2.No. 303 Hospital of People's Liberation Army， Nanning 530021，China）

Abstract： The extraction technology for total flavonoids were optimized with the content of total flavonoids as test index by orthogonal design. A novel method for determining total flavonoids was developed. The results showed that the factors affecting the total flavonoids extraction were in the order of methanol concentration， solvent amounts， ultrasonic time and soak time. The best extraction technology was as follows： 20 mL 100% methanol， soak time 30 min， ultrasonic time 30 min. The method of determing total flavonoids content was proved to be feasible， effective and simple.

Key words： leaves of Lycopersicon esculentum Mill.； total flavonoids； content determination； UV-vis spectrophotometry； orthogonal design

番茄叶是茄科（Solanceae）茄属（Solanum L.）的多年生草本植物番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）的叶子，其食用部位为多汁的浆果番茄，又称西红柿。番茄叶散发着特殊气味，这些气味来自一些特殊的天然产物，早在20世纪70～80年代，国外就开始研究其气味的组成[1，2]。从番茄叶中分离出的挥发性成分多为含氮化合物和酯类化合物，具有特殊气味，有较强的水溶性[3]。此外，还发现番茄叶中含有多种抑菌活性成分，这些活性物质既有强极性的，又有非极性和弱极性的，可用于多种溶剂的提取[4，5]。

番茄是广西壮族自治区一种重要的农业栽培作物，各地均普遍栽培，每年产生大量且不被利用的番茄叶。本研究拟从番茄叶中提取可作为天然抗氧化剂的物质，不仅可提高资源的利用率，而且可带动番茄产业链，将产生巨大的经济效益和深远的社会意义。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 8453型紫外可见分光光度计（美国安捷伦科技有限公司）；CP224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；SB25-12D型超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，功率600 W，频率50 Hz）。

番茄叶（批号：20090312、20090416、20090411）来源于广西百色国家农业科技园区优质无公害蔬菜产业化示范园；芦丁标准品（中国药品生物制品检验所提供，批号为080-9303）；其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制 精确称取干燥芦丁对照品15.20 mg，置于25 mL容量瓶中，100%甲醇溶解，定容，得标准储备液（含无水芦丁0.608 0 mg/mL）。精确移取芦丁对照液2.0 mL置于25 mL容量瓶中，加蒸馏水至6 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1.00 mL，摇匀，静置6 min；再加10%硝酸铝溶液1.00 mL，摇匀，静置6 min；再加4%氢氧化钠溶液10.00 mL，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置15 min，以空白调零，从400～800 nm进行全波长扫描，测得510 nm处有最大吸收，因此以510 nm为测定波长，结果见图1。

准确量取芦丁储备液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于25 mL容量瓶中，测定溶液吸光度，以吸光度为纵坐标，溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，并根据标准曲线求出总黄酮浓度-吸光度标准曲线，得出总黄酮浓度-吸光度回归方程：A=11.289C-0.095 11，相关系数r=0.999 7。由标准曲线可知在0.024 03～0.072 96 mg/mL范围内线性关系良好。

1.2.2 番茄叶中总黄酮的提取工艺研究

甲醇超声提取法：称取番茄叶粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，超声60 min，过滤，备用。

甲醇水浴回流提取法：称取番茄叶粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，回流60 min， 过滤，备用。

乙醇超声提取法：称取番茄叶粗粉0.5 g，加乙醇25 mL，超声60 min，过滤，备用。

1.2.3 单因素试验与正交试验设计 根据单因素试验结果进行正交试验。选用甲醇浓度、溶剂量、超声时间及浸泡时间4个因素，每个因素选择3个水平，用L9（34）进行正交试验设计优选。因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 番茄叶中总黄酮的提取工艺研究结果

精确吸取样品液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.1”操作，于510 nm测溶液吸光度，计算样品总黄酮含量，结果见表2。由表2可知，最佳提取法为甲醇超声提取法。

2.2 正交试验结果

采用正交试验设计，选用甲醇浓度、溶剂量、超声时间及浸泡时间4个因素，每个因素选择3个水平，用L9（34）正交表进行试验设计优选，结果见表3。由表3可知，正交试验的最优水平为A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超声30 min提取，测得的总黄酮含量最高，确定其为提取番茄叶总黄酮的最佳工艺。影响番茄叶总黄酮提取的主次因素依次为甲醇浓度、溶剂量、超声时间、浸泡时间。

2.3 验证试验

取批号为20090312的番茄叶，以正交试验的最优水平为A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超声30 min提取，测定其总黄酮含量进行验证对比试验。由表4可知，在上述工艺条件下，提取的总黄酮含量较高，达到了优化工艺的目的。

2.4 总黄酮含量的测定

2.4.1 精密度试验 精确称取番茄叶甲醇提取物样品1份，按“1.2.1”项下操作，于510 nm测其吸光度值，计算RSD为0.085%（n=6），说明精密度较高。

2.4.2 稳定性试验 将同一份番茄叶甲醇提取物样品液，按“1.2.1”项下分别于0、10、20、30、40、50、60 min测定其吸光度值，计算RSD为0.74%，表明供试液中黄酮在测定的60 min内可保持稳定。

2.4.3 重复性试验 将同一待测番茄叶提取液按“1.2.1”进行操作，平行测定6次，结果RSD为1.5%。

2.4.4 回收率的测定 准确称取3份番茄叶甲醇提取物样品，每份0.20 g。分别加入一定量的芦丁标准品，按“1.2.1”项下操作，在510 nm测吸光度，得出总黄酮含量。回收率结果见表5。

2.4.5 不同批号番茄叶总黄酮含量测定 准确称取三批样品6份各0.4 g，按“1.2.1”项下操作，测定溶液吸光度，将吸光度代入回归方程计算得到总黄酮的浓度，并计算得其含量。番茄叶提取物中总黄酮的含量见表6。

3 小结与讨论

1）番茄叶中可能含有黄酮。黄酮具有广泛的生物活性，为了进一步研究番茄叶的总黄酮含量，本研究首次用正交试验设计，对番茄叶中总黄酮的提取工艺进行了研究。在试验中，先考察了提取的影响因素，除了提取方法外，超声时间、甲醇浓度、浸泡时间和溶剂量对提取效率均有影响，故以这些参数设计了正交试验，确定了影响番茄叶总黄酮提取的主次因素依次为：甲醇浓度>溶剂量>超声时间>浸泡时间，最佳提取方案为100%甲醇20 mL浸泡30 min后超声30 min提取。

2）本研究采用紫外-可见分光光度法测定了番茄叶中总黄酮的含量，精密度、稳定性和重复性良好，加样回收率合格，为番茄叶中总黄酮的含量测定提供了一种简便可行的方法，为番茄叶的质量控制提供了评价手段。

参考文献：

[1] DIRINCK P，SCHREYEN L，SCHAM P N.Flavor qualily of apples and tomatoes[J]. Appl Spectrom Mass（SM），1975，15（4）：427-435.

[2] LUNDGREN L，NORELIUS C，STENHAGEN G. Leaf volatiles from some wild tomato species[J]. Nord J Bot，1985，5（4）：315-320.

[3] 李水清，于信洋. 番茄茎叶提取物对菜粉蝶的生物活性研究[J]. 长江大学学报（自然科学版），2007，4（2）：1-4.

[4] 杨从军，孟昭礼，郭 景，等.番茄茎叶提取物对8种植物病原菌的生物活性初步研究[J].植物保护，2005，31（1）：28-31.

[5] 银永忠，何青云，陈莉华，等. 废弃番茄叶中叶绿素超声-微波协同的提取工艺[J]. 光谱实验室，2011，28（5）：2578-2583.

1.2.2 番茄叶中总黄酮的提取工艺研究

甲醇超声提取法：称取番茄叶粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，超声60 min，过滤，备用。

甲醇水浴回流提取法：称取番茄叶粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，回流60 min， 过滤，备用。

乙醇超声提取法：称取番茄叶粗粉0.5 g，加乙醇25 mL，超声60 min，过滤，备用。

1.2.3 单因素试验与正交试验设计 根据单因素试验结果进行正交试验。选用甲醇浓度、溶剂量、超声时间及浸泡时间4个因素，每个因素选择3个水平，用L9（34）进行正交试验设计优选。因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 番茄叶中总黄酮的提取工艺研究结果

精确吸取样品液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.1”操作，于510 nm测溶液吸光度，计算样品总黄酮含量，结果见表2。由表2可知，最佳提取法为甲醇超声提取法。

2.2 正交试验结果

采用正交试验设计，选用甲醇浓度、溶剂量、超声时间及浸泡时间4个因素，每个因素选择3个水平，用L9（34）正交表进行试验设计优选，结果见表3。由表3可知，正交试验的最优水平为A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超声30 min提取，测得的总黄酮含量最高，确定其为提取番茄叶总黄酮的最佳工艺。影响番茄叶总黄酮提取的主次因素依次为甲醇浓度、溶剂量、超声时间、浸泡时间。

2.3 验证试验

取批号为20090312的番茄叶，以正交试验的最优水平为A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超声30 min提取，测定其总黄酮含量进行验证对比试验。由表4可知，在上述工艺条件下，提取的总黄酮含量较高，达到了优化工艺的目的。

2.4 总黄酮含量的测定

2.4.1 精密度试验 精确称取番茄叶甲醇提取物样品1份，按“1.2.1”项下操作，于510 nm测其吸光度值，计算RSD为0.085%（n=6），说明精密度较高。

2.4.2 稳定性试验 将同一份番茄叶甲醇提取物样品液，按“1.2.1”项下分别于0、10、20、30、40、50、60 min测定其吸光度值，计算RSD为0.74%，表明供试液中黄酮在测定的60 min内可保持稳定。

2.4.3 重复性试验 将同一待测番茄叶提取液按“1.2.1”进行操作，平行测定6次，结果RSD为1.5%。

2.4.4 回收率的测定 准确称取3份番茄叶甲醇提取物样品，每份0.20 g。分别加入一定量的芦丁标准品，按“1.2.1”项下操作，在510 nm测吸光度，得出总黄酮含量。回收率结果见表5。

2.4.5 不同批号番茄叶总黄酮含量测定 准确称取三批样品6份各0.4 g，按“1.2.1”项下操作，测定溶液吸光度，将吸光度代入回归方程计算得到总黄酮的浓度，并计算得其含量。番茄叶提取物中总黄酮的含量见表6。

3 小结与讨论

1）番茄叶中可能含有黄酮。黄酮具有广泛的生物活性，为了进一步研究番茄叶的总黄酮含量，本研究首次用正交试验设计，对番茄叶中总黄酮的提取工艺进行了研究。在试验中，先考察了提取的影响因素，除了提取方法外，超声时间、甲醇浓度、浸泡时间和溶剂量对提取效率均有影响，故以这些参数设计了正交试验，确定了影响番茄叶总黄酮提取的主次因素依次为：甲醇浓度>溶剂量>超声时间>浸泡时间，最佳提取方案为100%甲醇20 mL浸泡30 min后超声30 min提取。

2）本研究采用紫外-可见分光光度法测定了番茄叶中总黄酮的含量，精密度、稳定性和重复性良好，加样回收率合格，为番茄叶中总黄酮的含量测定提供了一种简便可行的方法，为番茄叶的质量控制提供了评价手段。

参考文献：

[1] DIRINCK P，SCHREYEN L，SCHAM P N.Flavor qualily of apples and tomatoes[J]. Appl Spectrom Mass（SM），1975，15（4）：427-435.

[2] LUNDGREN L，NORELIUS C，STENHAGEN G. Leaf volatiles from some wild tomato species[J]. Nord J Bot，1985，5（4）：315-320.

[3] 李水清，于信洋. 番茄茎叶提取物对菜粉蝶的生物活性研究[J]. 长江大学学报（自然科学版），2007，4（2）：1-4.

[4] 杨从军，孟昭礼，郭 景，等.番茄茎叶提取物对8种植物病原菌的生物活性初步研究[J].植物保护，2005，31（1）：28-31.

[5] 银永忠，何青云，陈莉华，等. 废弃番茄叶中叶绿素超声-微波协同的提取工艺[J]. 光谱实验室，2011，28（5）：2578-2583.

1.2.2 番茄叶中总黄酮的提取工艺研究

甲醇超声提取法：称取番茄叶粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，超声60 min，过滤，备用。

甲醇水浴回流提取法：称取番茄叶粗粉0.5 g，加甲醇25 mL，回流60 min， 过滤，备用。

乙醇超声提取法：称取番茄叶粗粉0.5 g，加乙醇25 mL，超声60 min，过滤，备用。

1.2.3 单因素试验与正交试验设计 根据单因素试验结果进行正交试验。选用甲醇浓度、溶剂量、超声时间及浸泡时间4个因素，每个因素选择3个水平，用L9（34）进行正交试验设计优选。因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 番茄叶中总黄酮的提取工艺研究结果

精确吸取样品液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.1”操作，于510 nm测溶液吸光度，计算样品总黄酮含量，结果见表2。由表2可知，最佳提取法为甲醇超声提取法。

2.2 正交试验结果

采用正交试验设计，选用甲醇浓度、溶剂量、超声时间及浸泡时间4个因素，每个因素选择3个水平，用L9（34）正交表进行试验设计优选，结果见表3。由表3可知，正交试验的最优水平为A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超声30 min提取，测得的总黄酮含量最高，确定其为提取番茄叶总黄酮的最佳工艺。影响番茄叶总黄酮提取的主次因素依次为甲醇浓度、溶剂量、超声时间、浸泡时间。

2.3 验证试验

取批号为20090312的番茄叶，以正交试验的最优水平为A3B2C1D3，即用100%甲醇20 mL浸泡30 min后超声30 min提取，测定其总黄酮含量进行验证对比试验。由表4可知，在上述工艺条件下，提取的总黄酮含量较高，达到了优化工艺的目的。

2.4 总黄酮含量的测定

2.4.1 精密度试验 精确称取番茄叶甲醇提取物样品1份，按“1.2.1”项下操作，于510 nm测其吸光度值，计算RSD为0.085%（n=6），说明精密度较高。

2.4.2 稳定性试验 将同一份番茄叶甲醇提取物样品液，按“1.2.1”项下分别于0、10、20、30、40、50、60 min测定其吸光度值，计算RSD为0.74%，表明供试液中黄酮在测定的60 min内可保持稳定。

2.4.3 重复性试验 将同一待测番茄叶提取液按“1.2.1”进行操作，平行测定6次，结果RSD为1.5%。

2.4.4 回收率的测定 准确称取3份番茄叶甲醇提取物样品，每份0.20 g。分别加入一定量的芦丁标准品，按“1.2.1”项下操作，在510 nm测吸光度，得出总黄酮含量。回收率结果见表5。

2.4.5 不同批号番茄叶总黄酮含量测定 准确称取三批样品6份各0.4 g，按“1.2.1”项下操作，测定溶液吸光度，将吸光度代入回归方程计算得到总黄酮的浓度，并计算得其含量。番茄叶提取物中总黄酮的含量见表6。

3 小结与讨论

1）番茄叶中可能含有黄酮。黄酮具有广泛的生物活性，为了进一步研究番茄叶的总黄酮含量，本研究首次用正交试验设计，对番茄叶中总黄酮的提取工艺进行了研究。在试验中，先考察了提取的影响因素，除了提取方法外，超声时间、甲醇浓度、浸泡时间和溶剂量对提取效率均有影响，故以这些参数设计了正交试验，确定了影响番茄叶总黄酮提取的主次因素依次为：甲醇浓度>溶剂量>超声时间>浸泡时间，最佳提取方案为100%甲醇20 mL浸泡30 min后超声30 min提取。

2）本研究采用紫外-可见分光光度法测定了番茄叶中总黄酮的含量，精密度、稳定性和重复性良好，加样回收率合格，为番茄叶中总黄酮的含量测定提供了一种简便可行的方法，为番茄叶的质量控制提供了评价手段。

参考文献：

[1] DIRINCK P，SCHREYEN L，SCHAM P N.Flavor qualily of apples and tomatoes[J]. Appl Spectrom Mass（SM），1975，15（4）：427-435.

[2] LUNDGREN L，NORELIUS C，STENHAGEN G. Leaf volatiles from some wild tomato species[J]. Nord J Bot，1985，5（4）：315-320.

[3] 李水清，于信洋. 番茄茎叶提取物对菜粉蝶的生物活性研究[J]. 长江大学学报（自然科学版），2007，4（2）：1-4.

[4] 杨从军，孟昭礼，郭 景，等.番茄茎叶提取物对8种植物病原菌的生物活性初步研究[J].植物保护，2005，31（1）：28-31.

[5] 银永忠，何青云，陈莉华，等. 废弃番茄叶中叶绿素超声-微波协同的提取工艺[J]. 光谱实验室，2011，28（5）：2578-2583.