高效液相色谱法测定八味和胃口服液中延胡索乙素含量

(贵州省遵义市食品药品检验所，贵州 遵义 563000)

八味和胃口服液由五灵脂、竹茹、延胡索(醋制)、木香、五味子、甘草、麦冬、沙参八味等组方[1]。有养阴和胃、理气止痛的功效，适用于胃阴虚证导致的胃中嘈杂、胃脘隐痛、口燥咽干、大便干结。该制剂原质量标准中延胡索乙素含量测定采用紫外分光光度法[2]，受其溶液颜色影响，干扰较大。为了有效控制该制剂的质量，笔者采用高效液相色谱法(HPLC)法测定延胡索乙素的含量，该方法操作简便、准确、重复性好，可为八味和胃口服液质量标准的提升提供参考依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；ABS-204型电子天平(梅特勒-托利多仪器公司)。延胡索乙素对照品(中国食品药品检定研究院，批号为110726-201109)；八味和胃口服液(贵州百花医药股份有限公司，批号分别为130301，130302，130303)；阴性样品(自制)；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Eclise Plus C18柱(100mm×4.6mm，3.5μm)；流动相:乙腈-用三乙胺调节pH至6.0的0.1%磷酸溶液(40∶60)；流速:1.0mL/min；检测波长:280nm；柱温:30℃。理论板数按延胡索乙素峰计应不低于3000。在此条件下，色谱图见图1。

2.2 溶液制备

称取延胡索乙素对照品12.55 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，取5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密量取本品20 mL，试液调节(pH=10～11)，用乙醚100 mL水浴回流提取2次，每次15 min，合并乙醚液，低温蒸干，将残渣用甲醇溶解移入10 mL容量瓶中，定容至刻度，滤过，取续滤液，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。按处方工艺制备缺延胡索药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

干扰试验:分别吸取阴性对照品溶液、对照品溶液及供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪。结果供试品溶液色谱中，延胡索乙素峰保留时间与对照品峰的保留时间一致，阴性无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察:精密吸取对照品溶液 2，5，10，15，20 μL，按拟订色谱条件进样，测定峰面积，以对照品质量浓度(X，μg/mL)为横坐标、峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y=10.270 X-3.014 6，r=0.999 8(n=5)。结果表明，延胡索乙素质量浓度在5.02～50.2 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验:取同一对照品溶液，连续进样6次，每次10 μL，测定延胡索乙素的峰面积。结果峰面积平均值为256.5，RSD为0.9%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液，分别于0，4，8，12，16，24 h时进样测定峰面积。结果延胡索乙素峰面积的RSD为0.80%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验:取同一批(批号为130303)样品，依法平行制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件依法进样测定。结果样品中延胡索乙素的平均含量为12.34 μg/mL，RSD为1.4%(n=6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验:精密量取已知延胡索乙素含量(12.34 μg/mL)的样品10 mL(批号为130303)共6份，精密分别加入延胡索乙素对照品溶液5 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液，按拟订色谱条件依法进样测定峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 延胡索乙素加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取样品3批，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定峰面积，按外标法以峰面积计算样品含量。结果批号为130301，130302，130303的样品中延胡索乙素含量为15.2，12.3，12.5μg/mL(n=3)。

3 讨论

在200～400 nm波长范围内，对延胡索乙素对照品溶液进行光谱扫描。结果延胡索乙素最大吸收波长为282 nm，故选择测定波长为280 nm。

考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相溶剂系统并调节不同pH进行考察[3-5]。结果表明，乙腈-用三乙胺调节pH至6.0的0.1%磷酸溶液(40∶60)为流动相，延胡索乙素色谱峰峰形较好，与其他峰能完全达到分离效果。

在试验过程中，分别考察了以乙醚作提取溶剂，超声提取30min和回流提取2次[6-7]的样品测定结果，结果表明，乙醚回流提取2次效果较好。同时考察了回流提取2次(每次10，15，20 min)的提取效果，结果表明，回流提取15 min，提取2次，提取较完全。因此，采用乙醚回流提取2次，每次15 min。

参考文献：

[1]WS-60000(B-1000)-2002，国家药品监督管理局药品标准(试行)[S].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:130-131，525.

[3]李延雪，苏玉娟，宋宝鹏.HPLC法测定元胡止痛片中延胡索乙素的含量[J].中国药事，2006，20(9):544-545.

[4]杨天展.高效液相色谱法测定胃得康散中延胡索乙素的含量[J].时珍国医国药，2000，11(1):31-32.

[5]郑 琴，郝伟伟，杨 明.HPLC同时测定止痛胶囊中2种生物碱的含量[J].中成药，2007，29(12):1 791-1 794.

[6]王 捷，龙 禹，焦爱军，等.HPLC测定安神养血口服液中3种生物碱延胡索乙素、钩藤碱和异钩藤碱含量[J].中成药，2010，32(2):231-235.

[7]卢耀文，杨中林.延胡索乙素提取工艺优选研究[J].中成药，2008，30(8):1 247-1 249.