PAX6在酒精处理幼鼠神经细胞损伤的影响

赵娟等

【摘要】目的：探究PAX6在酒精处理幼鼠中对神经细胞损伤的影响。方法：妊娠5d小鼠随机分为2组，在仔鼠出生后7天时建模，实验组用20%的酒精溶液，按每只2.5克/千克分两次皮下注射，两次间隔两小时；对照组用生理盐水代替酒精做同样的处理。24h后，取脑组织切片进行HE和PAX6免疫组化染色。结果：HE染色结果说明皮质和丘脑下部均有一定量神经细胞发生凋亡，免疫组化显示实验组中PAX6的在皮质和丘脑下部的表达均较对照组明显升高。结论：酒精对仔鼠神经细胞的损伤可能与PAX6转录因子过量表达有关。

【关键词】酒精；PAX6；转录因子；神经细胞；凋亡

【中图分类号】R245 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）01-0269-01

基金项目：湖南省教育厅科技项目（12C0510）

酒精作为常见的致畸原，与人类的生长发育紧密相关。能够使中枢神经系统病变、以及精神行为异常等[1]。目前认为酒精是导致儿童智力障碍的可预防的非遗传性因素。酒精对神经细胞有直接或间接的毒害作用，可造成中枢神经系统神经细胞的大量凋亡[2]，尤其是在快速发育期或突触形成期，即使接触一次酒精也能造成小鼠大脑皮质和小脑神经元的凋亡[3]。

PAX6基因编码一种转录因子，在脊椎动物中不仅对中枢神经系统生长有重要的作用[4]，还对脑的发育和结构完整性有一定影响[5]。PAX6的作用在正常和异常的细胞增生中均有影响，广泛覆盖细胞的增生、移行、黏附和信号传导等各个途径[6]。本文就酒精处理仔鼠中PAX6的表达情况作一研究，为临床上酒精对神经细胞损伤的治疗和研究提供实验依据和理论基础。

1材料和方法

（1） 动物与药品、器材：湖南农大动物中心提供的成年昆明小鼠，体重20-30g；56°红星二锅头，由北京红星股份有限公司提供；PAX6抗体购自英国abcam公司，冰冻切片机是德国slee公司MEV型号；显微镜是日本OLYMPUS公司BX51T-32P01型。

（2） 实验动物的分组：雌、雄鼠合笼，每日8时检查雌鼠是否有阴道栓确定

受孕日期，定为妊娠开始，妊娠5d小鼠随机分为2组：对照组和试验组。幼鼠出生第1天称为P0（P=days postnatal，P0=the first 24hours afterbirth），在仔鼠P7龄时，按Ikonomidou C的方法建模[7]，试验组用20%的酒精溶液，每只按2.5克/千克分兩次皮下注射，两次间隔两小时；对照组用生理盐水代替酒精做同样的处理，24小时后，取材对大脑进行组织检查。

（3） 取2组幼鼠，2.5%三溴乙醇（16mL/kg）腹腔注射麻醉，用生理盐水和4%多聚甲醛经心灌流。取出大脑组织，4%甲醛固定过夜，30%蔗糖脱水至组织沉底。PBS（0.1 mol/L，pH7.4）液冲洗干净后，用包埋胶-30℃包埋，制成切片标本。冰冻切片机切片，厚度为20μm。

（4） HE染色：苏木素染色，自来水洗，分化，自来水浸泡，伊红染色，常规脱水、透明、封片。

（5） 免疫组化：一抗是rabbit anti-PAX6 receptor，切片置于4 ℃含一抗的体积分数为5%血清和0.3%Triton-100的PBS溶液中反应过夜，次日经PBS浸洗后，切片在相应的二抗里孵育2 h，HRP标记链霉菌抗生素蛋白三抗1h，DAB显色，然后在显微镜下观察检测。

2结果

2.1 酒精对神经细胞的影响

对照组中神经细胞形态规则并可见突触，而在实验组中细胞在组织中成单个散在分布，呈圆形，细胞核聚集成团块状深染，胞质浓缩红染，说明在实验组酒精处理后神经细胞发生凋亡[8]。（图1）

3讨论

酒精是一种亲神经物质，对人体许多系统器官均有损伤作用，其中神经系统是其损伤的重要靶器官之一。研究显示酒精暴露可导致儿童脑发育障碍进而引起学习、记忆、智力水平下降和精神行为功能缺陷，即使停止滥用，已造成的损害仍将继续。

实验结果证明了PAX6转录因子在幼鼠皮质和丘脑下部中的表达，进一步的免疫组化分析显示，主要在两个区域内表达上调。这些实验初步论证了幼鼠皮下注射酒精后以后，PAX6转录因子上调与神经细胞死亡的关系。对于临床上酒精致神经细胞损伤治疗来说，PAX6有望作为一个基因诊断和基因治疗的靶点[9]。

综上所述，在酒精导致神经元损伤过程中PAX6的过量表达可能是重要机制之一。现今认为的机制可能有：自由基损伤，视黄醛缺少，基因表达水平改变，细胞膜结构变化和生长因子活性改变五大类。酒精可能通过这些不同的机制协同起作用，使中枢神经发生一系列生化反应，造成分子、细胞等各水平变化，最终导致了神经细胞的损伤。

参考文献

[1]许雅君，柳鹏，李勇.酒精对小鼠胚胎脑线粒体发育的影响[J].卫生研究，2005，34（1）：61-63.

[2]Nowoslawski L，Klocke BJ，Roth KA.Molecular regulation of acute ethanol-induced neuron apoptosis[J].J Neuropathol Exp Neurol，2005，64（6）：490.

[3]Dikranian K，Qin YQ，Labruyere J，et a1.Ethanol-induced neuroapoptosis in the developing rodent cerebellum and related brain stem structures[J].Brain Res Dev Brain Res，2005，155（1）：1.

[4]王家增，孙晋浩，杨琳.神经干细胞体外研究的现状[J].山东医学高等专科学校学报，2006，28（5）：391-394.

[5]Engelkamp D，Rashbass P，Seawright A.Role of Pax6 in development of the cerebellar system[J].Development，1999，126：3585-3596.

[6]Simpson TI，Price DJ.PAX6 a pleiotropic player in development[J].Bioessays，2002，24（11）：1041-1051.

[7]Ikonomidou C，Bittigau P，Ishimaru M J.Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome[J].Science，2000，2879（11）：1056-1060.

[8]魏文科.介绍一种观察凋亡细胞形态学特征的染色方法——苏木素-伊红染色法（HE染色法）[J].生物学通报，2003，38（5）：49-50.

[9]李艺，彭英.胎儿酒精中毒综合征及其发病机理的研究进展[J].中国神经精神疾病，2008，34（3）：188-190.