UPLC-MS-MS法检测辣椒及其制品和肉酱中的罗丹明B含量

周海珍 臧永军 唐菊 曹艳云

摘 要：建立了辣椒及其制品和肉酱中罗丹明B含量的超高效液相色谱-串联质谱联用检测方法。样品经乙腈提取后，经中性氧化铝固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法检测。本方法定量限0.1 μg/kg，线性范围0.2～50 ng/mL；在罗丹明B添加水平0.1～10 μg/kg时，辣椒片样品中的回收率76%～92%，辣椒制品中的回收率74%～93%，肉酱样品中的回收率70%～90%。

关键词：罗丹明B；超高效液相色谱-串联质谱联用；辣椒及其制品；肉酱

Determination of Rhodamine B in Hot Pepper and Its Products as well as Meat Sauce by UPLC-MS-MS

ZHOU Hai-zhen, ZANG Yong-jun, TANG Jun, CAO Yan-yun

(Technical Center, Shineway Group Co. Ltd., Luohe 462003, China)

Abstract: A method for the determination of rhodamine B in hot pepper and its processed products as well as meat sauce by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS) was established. Samples were extracted with acetonitrile, then cleaned up with a neutral aluminum oxide solid-phase extraction cartridge, and detected by UPLC-MS-MS. The limit of quantitation (LOQ) was 0.1 μg/kg, and the calibration curve was linear in the range of 0.2 to 50 ng/mL for this method. At spiked levels of 0.1–10 μg/kg, the recoveries of rhodamine B ranged from 76% to 92% in hot pepper, from 74% to 93% in hot pepper products, and from 70% to 90% in meat sauce.

Key words: rhodamine B; UPLC-MS/MS; hot pepper and its products; meat sauce

中图分类号：TS252.7文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）02-0022-03

罗丹明B，又名玫瑰红B、碱性玫瑰精，是一种具有鲜桃红色的人工合成染料，通常用在皮革加工、有色玻璃、烟花制造等工业领域[1-2]。因罗丹明B的着色效果好，色泽鲜亮，也被不法商家应用于辣椒及其制品和调味酱等的染色。有研究表明：罗丹明B对人体具有潜在的致癌性[2-4]，因此禁止用作食品添加剂。

目前，罗丹明B的检测方法主要包括液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[5-9]、

液相色谱-串联质谱联用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）[10]等，前处理方法主要包括凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）净化和固相萃取（solid phase extraction，SPE）净化等方法。由于GPC净化比较费时，且产生大量废液；而文献中的固相萃取法主要采用C18柱、HLB柱或MCX柱，成本较高[11-13]。本实验采用自制中性氧化铝柱净化，具有成本低、净化效果好等优点，结合UPLC-MS-MS

的定性定量准确、快速等优势[14-19]，建立了一种应用UPLC-MS-MS法测定复杂基质辣椒及其制品和肉酱中罗丹明B含量的定性定量分析和确证方法，以期为复杂基质中罗丹明B的测定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗丹明B标准品（纯度95%） 美国Sigma公司；乙腈、甲酸 美国Fisher公司；甲酸铵 美国Alfa Aesar公司；中性氧化铝固相萃取柱 自制；辣椒片、辣椒制品、肉酱 市售。

1.2 仪器与设备

Xevo TQ MS超高效液相色谱-串联质谱联用仪 美国Waters公司；电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；VX-III型多管平行振荡器 北京Targin公司；KQ-500DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；GL-21M型离心机 湖南湘仪离心机有限公司；氮气发生器 英国Peak公司；N-EVAP112型氮吹仪 德国OA-SYS公司；旋转蒸发装置 日本Eyela公司；固相萃取装置 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备液：准确称取10.53 mg罗丹明B标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，即为100 μg/mL的标准储备液，避光储存于4 ℃冰箱中。

标准中间液：准确吸取1.00 mL 质量浓度为100 μg/mL

罗丹明B标准储备液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀，即为1.0 μg/mL的标准中间液，避光储存于4 ℃冰箱中。

1.3.2 标准系列

用乙腈将罗丹明B标准中间液稀释成0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的标准系列。

1.3.3 样品处理[5-10]

样品提取：称取处理均匀的样品（2.00±0.01）g于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL乙腈，于多管平行振荡器上振荡提取30 min，超声提取15 min，7000 r/min

离心5 min，取全部上清液转入另一50 mL离心管中，待净化。

样品净化：在固相萃取管底部装上筛板，装入3.0 g经135 ℃烘干4 h的中性氧化铝基准试剂，在氧化铝上层加盖筛板，固定柱体。将提取液全部通过自制氧化铝柱，用5 mL丙酮淋洗，抽干；用10 mL乙腈∶水为9∶1

（V/V）混合溶液洗脱，洗脱液于50 ℃氮吹仪上挥发至干，用1 mL质谱纯乙腈复溶，超声溶解后过0.45 μm有机滤膜，滤液待测。

1.3.4 液相色谱条件

Waters BEH-C18 柱（2.1×50 mm，1.7μm）；柱温40 ℃；进样量5 μL；流动相A：5 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸水溶液；B：乙腈。洗脱梯度：初始流动相B为10%，0～2 min，B的比例等度变为90%，3 min回到初始流动相并保持1 min，总分析时间为4 min。

1.3.5 质谱条件

采用ESI+多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，电离电压3.0 kV，源温150 ℃，雾化气温度450 ℃，雾化气流量900 L/h，锥孔气流量20 L/h，碰撞气为高纯氩气。经优化，罗丹明B的母离子m/z 443.43，锥孔电压40 V，定量离子对m/z 443.43/399.30，碰撞能

35eV，定性离子对m/z 443.43/355.28，碰撞能45 eV。

2 结果与分析

2.1 提取试剂选择

实验分别选用正己烷、乙腈和乙酸乙酯∶环己烷为1∶1（V/V）作为提取试剂，按1.3.3节进行前处理，结果表明，采用乙酸乙酯∶环己烷为1∶1（V/V）提取后的样液颜色很深，可能是因为辣椒及其制品和肉酱中的非极性杂质被充分提取，经氧化铝柱净化后样液颜色仍较深，样品的基质效应较为严重，回收率相对较低；而采用乙腈提取时，罗丹明B能得到充分的提取，油脂类等非极性杂质在乙腈中溶解较少，净化后上机样液基本无色，样品受基质影响较小，回收率较高，所以，最终选用乙腈作为提取试剂。

2.2 洗脱液选择

选用135 ℃烘干活化4 h后中性氧化铝作为固相萃取填料，上样和淋洗时尽可能减少水的引入，洗脱时将水按体积比加入乙腈或甲醇中，氧化铝填料经水去活化后将目标物洗脱下来。结果表明，水＋乙腈的组合洗脱效果优于水＋甲醇的组合洗脱效果，而当水∶乙腈的比例为1∶9（V/V）时，罗丹明B已被完全洗脱，且大部分极性杂质被氧化铝柱截留，所以最终选用水∶乙腈为1∶9（V/V）作为洗脱液。

2.3 质谱条件优化

罗丹明B在ESI+电离模式下易得到H+形成较为稳定的[M+H]+的分子离子，本实验对1 μg/mL罗丹明B标准溶液进行全扫描和子离子扫描，获得罗丹明B的母离子扫描图和特征碎片离子扫描图（图1），选择丰度比最强的碎片离子对m/z 443.43/399.30为定量离子对，丰度比较强的离子对m/z 443.43/355.28为定性离子对。

图 1 罗丹明B的母离子扫描图（A）和子离子扫描图（B）

Fig.1 Parent ion scan (A) and fragment ion scan (B) spectra of rhodamine B

2.4 线性方程和定量限

分别以定量离子峰面积y对含量x作标准曲线，其回归方程为y=1342.4x＋18.4，相关系数r=0.998。以RSN=10为定量限，罗丹明B的定量限为0.2 μg/mL；采用阴性样品中添加目标化合物的方法，按1.3.3节方法进行前处理，得到本方法的样品定量限为0.1 μg/kg。加标量为0.1 μg/kg时辣椒和肉酱中罗丹明B的总离子流图和定量离子色谱图如图2所示。

a、b分别为辣椒、肉酱中罗丹明B总离子流图；

c、d分别为辣椒、肉酱中罗丹明B定量离子色谱图。

图 2 辣椒和肉酱中罗丹明B的总离子流图和定量离子色谱图

Fig.2 Total ion chromatogram and quantitative ion chromatogram of rhodamine B in hot pepper products and meat sauce

2.5 加标回收率和精密度

由表1所示，罗丹明B在辣椒片样品中的回收率76%～92%，RSD 3.6%～5.8%，在辣椒制品中的回收率74%～93%，RSD 3.1%～9.0%，在肉酱样品中的回收率70%～90%，RSD 3.3%～9.5%。

3 结 论

本实验研究了复杂基质辣椒及其制品和肉酱中罗丹明B含量的检测方法，采用乙腈提取，自制中性氧化铝柱净化，水∶乙腈为1∶9（V/V）的溶液洗脱，UPLC-MS/MS测定。本方法定量限0.1 μg/kg，线性范围0.2～50 ng/mL，在辣椒片样品中的回收率76%～92%；辣椒制品中的回收率74%～93%；肉酱样品中的回收率70%～90%。本方法检测灵敏度高，杂峰干扰小，检出限低，适用于辣椒及其制品和肉酱中罗丹明B含量的定性定量分析和确证。

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