红松种鳞多酚抗肿瘤作用的研究

符群 徐明慧 高小棠 王振宇

摘要

[目的] 研究红松种鳞多酚对癌细胞体外增殖的抑制作用。[方法]分别采用不同浓度红松多酚提取液对人骨髓神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y、人肺腺癌细胞株A549、人皮肤癌细胞株A375、人肝癌细胞株HepG2、人卵巢癌细胞株SKOV3这5种常见的肿瘤细胞进行试验，采用MTT法检测体外细胞增殖抑制率。[结果]红松多酚提取物对SH-SY5Y、HepG2、SKOV3的抑制作用不明显，而对A549、A375均有抑制效果。[结论]在红松多酚提取液固形物含量为0.4 mg/ml时，其对A549细胞抑制效果最佳，在该浓度下，红松多酚提取液对人肺腺癌细胞A549的抑制率可达到55%。

关键词 红松；多酚；抗肿瘤；MTT

中图分类号 S791.26 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）27-0925-03

Study on the Antitumor Properties of Korean Pine Scale Polyphenols

FU Qun¹， XU Minghui¹， GAO Xiaotang¹， WANG Zhenyu2*

（1. School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Abstract [Objective] To study inhibition effect of Korean pine scale polyphenols on cancer cell in vitro proliferation. [Method] Using different concentration of Korean pine scale polyphenols extract， experiments were conducted on human bone marrow neuroblastoma cell line SH SY5Y and A549 lung adenocarcinoma cancer cells and human skin cancer cell lines A375， human liver cancer cell line HepG2， human ovarian cancer cell lines SKOV3. MTT was used to detect the inhibition rate on in vitro cell proliferation. [Result] Korean pine polyphenols extracts have no obvious inhibition effect on SHSY6Y， HepG2， SKOV3， while have inhibition effect on A549 and A375. [Conclusion] When the solid content in Korean pine polyphenols extracts is 0.4 mg/ml， the inhibition effect on A549 can up to 55%.

Key words Korean pine； Polyphenols； Antitumor； MTT

肿瘤（Tumor） 是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。由于肿瘤的产物（包括异位激素产生）或异常免疫反应（包括交叉免疫、自身免疫和免疫复合物沉积等）引起内分泌、神经、造血、消化、骨关节、肾脏、皮肤等系统发生病变，引起相应的临床症状，称为副肿瘤综合症状。肿瘤是细胞异常增生性疾病，严重危及人类的生命，尤其是癌肿。长期以来，人们为寻找安全有效的抗癌药物，对大量中药材进行抗癌活性筛选，目前已发现先导多酚类可以抑制肿瘤细胞的生长^[1]。

红松又名果松，属于松科植物，国家Ⅱ级重点保护野生植物，主要分布在我国东北长白山到小兴安岭一带，红松材质轻软，不易变形，耐腐能力强。目前，人们从松科植物中已分离出挥发性成分、三萜、二萜、木质素、二苯乙烯和黄酮等类型化合物，主要有抗真菌、抗细菌、抗肿瘤、抗HIV、抗氧化、趋避昆虫等活性，部分化合物可作为食品添加剂^[2]。除此之外，在红松中还能提取出许多酚类物质，因此红松除具有使用价值外，还在保健、医学、药用等方面有巨大的开发潜力。诸多研究表明，针形树种的种皮、树皮、种鳞等各个不同部位皆含有多酚类化合物，并且多为传统树木开发利用业中的废弃部分，这造成了资源的极大浪费。由于松多酚特有的超强活性，使得其质量评价成为重要的研究课题，建立有效的评价系统必将为其高效利用提供坚实的保障。

1 材料与方法

1.1 供试材料

红松种鳞采自长白山；人肺腺癌细胞株A549、人骨髓神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y、人皮肤癌细胞株A375、人肝癌细胞株HepG-2、人卵巢癌细胞株SKOV3均由哈尔滨医科大学药学院提供；高糖DMEM培养液、胰蛋白酶-EDTA消化液，购自北京索莱宝科技有限公司（Beijing Solarbio Science & Technology Co.Ltd）。

1.2 研究方法

1.2.1

红松多酚的制备。

称取200 g干燥红松种鳞粉末于烧杯中，以1∶20比例（m/V）加入60%乙醇4 000 ml。在50 ℃、2 400 Hz条件下超声1 h，将烧杯中提取液和残渣一同过纱布，保留提取液，将残渣放入烧杯中，继续以1∶20比例（m/V）加入60%乙醇4 000 ml，在50 ℃、2 400 Hz条件下超声1 h。将2次得到的红松种鳞多酚提取液合并，在45 ℃的条件下于旋转蒸发仪中浓缩。将预处理活化后的AB-8树脂装柱，层析法纯化多酚提取液，旋转蒸发溶剂，收集多酚纯化物（纯度达45%）。采用Folin-Ciocalteu法^[3]测定多酚含量。

1.2.2

细胞培养。

将肿瘤细胞培养于含10%小牛血清高糖DMEM培养液中，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中传代培养^[4-6]。

1.2.3

红松多酚对肿瘤细胞抑制率的测定。采用MTT比色法检测细胞增殖抑制率^[7-9]。取对数生长期的A549细胞，用适量0.25%的EDTA-胰蛋白酶将贴壁的细胞充分消化，再用新鲜的DMEM细胞培养液制成5×10⁴个/ml的细胞悬液，按每孔100 μl接种于96孔培养板中^[10]，空白列用PBS代替细胞悬液，将96孔培养板放置于37 ℃、5%CO₂恒温培养箱中培养12 h后，分别加入5 μl终浓度为1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/ml的多酚纯化液，每浓度设6个重复，另外设置1个对照组，继续培养24 h后，每孔中加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），培养4 h后取出。吸弃各孔中的上清液，并向每孔加入200 μl的二甲基亚砜（DMSO）。在恒速振荡器上振摇20 min，用酶标免疫测定仪在490 nm波长下测定各孔的吸光值（OD）。按公式（Ⅰ）计算红松多酚纯化液对肿瘤细胞的生长抑制率。

由图3可知，红松多酚提取物在高浓度（1.0，0.9，0.8，0.7 mg/ml）时对A375细胞的生长起抑制作用。利用SPSS中的ANOVA进行组间显著性统计分析，结果表明，红松多酚提取物浓度为1.0，0.9，0.8，0.7 mg/ml时，其对A375的抑制率与对照组相比均有极显著差异（P<0.01），而在低浓度（06，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1 mg/ml）时对A375细胞的生长起促进作用。

虽然高浓度的红松多酚提取物能够抑制A375细胞的生长，但抑制率并不高，红松多酚提取物的浓度为0.9 mg/ml时，其对A375细胞的抑制率仅达到17.15%。利用SPSS中的ANOVA进行组间显著性统计分析，1.0，0.9，0.8，0.7 mg/ml各浓度间抑制效果差异不显著。

通过计算，可以得出红松多酚提取物对A375细胞的IC50为12.282 mg/ml。说明当作用于A375细胞的红松多酚提取物浓度为12.282 mg/ml时，A375细胞死亡数量达到50%，即有1/2的A375细胞在红松多酚提取物的作用下死亡。但A375肿瘤细胞的IC50值与A549肿瘤细胞的IC50数值相比大很多，因此可以认为A549肿瘤细胞对红松多酚更为敏感。

2.4 红松多酚对HepG-2细胞增殖的影响

在预试验基础上，选取浓度范围为0.1～1.0 mg/ml多酚提取液，对其进行HepG-2肿瘤细胞增殖的抑制试验，该作用剂量范围内，多酚提取液对HepG-2细胞的抑制效果如图4所示。

由图5可知，红松多酚提取物对SKOV3细胞的生长起

到促进作用，低浓度的红松多酚提取物对SKOV3细胞生长

促进作用相对较弱，而高浓度的红松多酚提取物对SKOV3细胞有相对较强的促进生长作用，并且这种促进作用与红松

多酚提取物浓度存在一定的剂效关系，即随着红松多酚提取物浓度的增加，红松多酚对SKOV3细胞生长的促进作用越显著。推测可能是SKOV3细胞在10%胎牛血清高糖DMEM培养基，37 ℃，5% CO₂的培养条件下，红松多酚给予其营养，更有利于SKOV3细胞的生长。

3 结论

（1）通过比较5种细胞的平均OD值和细胞抑制率可以发现，红松种鳞多酚提取物对人骨髓神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人肝癌细胞HepG-2和人卵巢癌细胞SKOV3的抑制作用不明显，而在一定浓度下对人肺腺癌细胞A549和人皮肤癌细胞A375均有抑制效果。比较二者与红松种鳞多酚提取物作用时间24 h的IC50发现，人肺腺癌细胞A549的IC50为0.418 mg/ml，而人皮肤癌细胞A375的IC50为12.282 mg/ml。A549细胞的IC50远远低于A375细胞的IC50，可见人肺腺癌细胞A549比人皮肤癌细胞A375在红松种鳞多酚辅助治疗癌症方面具有更实际的研究意义。

（2）人肺腺癌细胞A549在红松种鳞多酚提取液固形物含量为0.4 mg/ml时，平均OD值最低，细胞抑制率最高。在该浓度下，红松多酚提取液对人肺腺癌细胞A549的抑制率能达到55%以上。

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