溃疡病菌诱导下毛白杨防御相关基因的应答反应

张秀英 宋瑞清 理永霞等

摘要[目的] 研究溃疡病菌诱导下毛白杨防御相关基因的应答反应。[方法] 以毛白杨为试验材料，用溃疡病菌对7月龄幼苗进行接种，提取诱导前后的毛白杨树皮mRNA，通过反转录生成cDNA，构建72 h差异表达的SSHcDNA文库。随机挑选199个阳性克隆进行测序，将测序结果与NCBI基因库中序列进行比较，并对这些EST在dbEST数据库进行同源检索分析，利用RTqPCR对文库中7个基因进行进一步分析。[结果] 172个EST找到了同源序列，其中有32个序列与防御相关。在毛白杨受到溃疡病菌诱导时，这些防御基因的表达量明显上升。[结论]该研究为开展毛白杨抗溃疡病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础。

关键词毛白杨；葡萄座腔菌；防御相关基因；抑制性消减cDNA文库；实时荧光定量PCR

中图分类号S763.13文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03555-04

基金项目林业公益性行业科研专项（201204501）；中国林科院院部基金（CAFYBB2011005-4）；科技部基础性工作专项（2009FY210100）。

作者简介张秀英（1977-），女，山东平原人，讲师，在读博士，从事分子生物学研究。*通讯作者，研究员，博士，博士生导师，从事森林病理学研究。

杨树溃疡病是一种慢性病，主要危害树干，分布广泛，严重影响了杨树幼苗及幼树的生长，已成为影响我国杨树人工林发展的主要因素之一。目前，对杨树-病原相互作用的分子机制研究主要集中在杨树与锈菌[1-2]和杨树与杨盘二孢菌[3]的相互作用研究，而对杨树-溃疡病菌的相互作用的分子机制研究较少[4]，从基因组水平上研究病原菌的致病机理和机制更少。由于互作系统本身的复杂性，要探究植物与病原菌互作的响应机制，阐明其中的分子机理，需要进一步深入开展关于基因调控机理方面的研究。

Diatchenko等[5]建立以PCR为基础的差减杂交技术，具有高灵敏性、目的序列富集程度高、操作简便、丰度相对一致等优点。该技术因其显著特点受到广泛关注，已成为差异表达基因的有效分离方法，迄今为止在林木病害研究中已有许多报道[6-7]。笔者用溃疡病高抗品种毛白杨作为试验材料，接种溃疡病菌（Botryosphaeria dothidea）72 h后构建cDNA文库，同时利用获得的EST测序结果进行实时PCR验证，进一步研究杨树树皮在溃疡病菌诱导后的基因表达情况。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1植物材料。毛白杨（Populus tomentosa Carr.），高抗树种，15年生，感病指数为0～6.0[8]，生长于中国林业科学院内，采摘1年生健康枝条，扦插1个月苗木生根后，挑选生长状态一致的幼苗进行定植，幼苗长至7月龄时用于试验。

1.1.2 病原菌及接种方法。试验菌株为Botryosphaeria dothidea菌株，菌株号为CXY001，分离于杨树溃疡病斑，经单孢培养鉴定，再回接，以此确认致病性（致病力中等），保存于中国林科院菌种保藏中心。试验前，先将病原菌活化，参考赵仕光等的接种方法并稍加修改[9]。接种72 h后取样，截取病健交界处0.5 cm×1.0 cm长条形树苗干部树皮（带形成层），约每500 mg样品用锡铂纸包成1包后，迅速投入液氮中，于-80 ℃下贮存备用（图1）。对照采用接种无菌培养基后72 h取样。

1.2试验方法

1.2.1 总RNA提取及mRNA的纯化。采用鼎国公司的植物RNA提取试剂盒提取毛白杨树皮的总RNA，使用Plant RNAzol试剂盒提取真菌的总RNA，使用微量紫外分光光度计进行RNA定量测定，利用Promega公司的mRNA分离纯化试剂盒[PolyA Tract SystemsⅢ（Z5300）]分离纯化mRNA，通过电泳检测其完整性。

1.2.2 构建抑制差减文库及重组子的鉴定。利用Clontech公司的抑制性消减杂交文库构建试剂盒（PCRSelectTM cDNA Subtraction Kit）构建溃疡病菌诱导毛白杨72 h的差减文库。在试验过程中以真菌接种处理的杨树树皮作为试验方（Tester）；参照方（Driver）一部分来源于培养基处理的杨树树皮的mRNA，一部分来源于培养基培养的真菌mRNA（图2）。将消减杂交反应后得到的cDNA与 pMD19T载体连接，导入感受态细胞，振荡培养，将转化菌涂在含有Amp抗性的LB平板上，37 ℃下培养16 h，通过蓝白斑筛选挑出阳性克隆，加入96孔细胞培养板中（含有Amp/LB液体培养基），摇床培养。吸取菌液，PCR扩增，检测插入片段的大小。

注：a.B. dothidea菌诱导毛白杨 72 h，作为试验方；b.培养72 h的菌丝；c.PDA培养基诱导毛白杨72 h。将培养72 h的菌丝与PDA培养基诱导72 h的毛白杨按1∶1（mRNA）的比例混合，作为参照方。

1.2.3 抑制消减杂交文库测序及序列分析。抑制消减杂交文库测序由鼎国公司完成，将获得的EST序列进行EST前处理，剔除不符合要求的序列，然后递交NCBI网站，通过NCBI网站上的BLAST（或者BLASTN）序列比对工具，在GenBank 的dbEST数据库上对EST序列进行同源检索分析。

1.2.4 Realtime PCR定量检测。使用7月龄苗木进行接种试验。以不接种溃疡病菌毛白杨苗木作为对照方，以接种溃疡病菌的毛白杨作为测试方，分别于接种后12、24、48、72、96和144 h取样，剪取对照和接种材料的树皮置于液氮中，-80 ℃下保存备用。每个接种时间处理5株毛白杨，重复3次。

以EF1α作为内参基因，根据内参基因设计特异性引物，依此来设计PCR反应的循环数及目的基因扩增的模板量。使用SYBR GREEN PCR MasterMix（TOYOBO）试剂盒进行荧光实时定量RTPCR，在7500循环仪（Biorad）进行实时定量PCR反应。Realtime PCR 反应体系包括2×SYBR Green Supermix（Qiagen）15 μl、正向和反向引物各0.5 μl，cDNA模板2 μl。PCR 反應条件为：95 ℃ 10 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，45个循环。采用2-ΔΔCT法对实时定量PCR结果进行定量分析，引物见表1。

2結果与分析

2.1 酶切效果分别取2 μg试验方和参照方的mRNA，经反转录生成双链cDNA，经限制性内切酶RsaⅠ酶切，结果表明RsaⅠ酶切后酶切的cDNA 大小范围明显小于未酶切的cDNA，说明酶切完全，符合试验要求，可以用于差减文库的构建（图3）。

2.2文库筛选及插入片段大小 RsaⅠ酶切后进行接头连接和2轮杂交，接着进行2轮抑制PCR，参照方和试验方的大部分共有序列已被差减消除，不同表达序列得到进一步富集。随机挑取100个克隆进行质粒抽提，再进行PCR扩增和凝胶电泳，其中有95个存在有效产物。克隆的插入片段大小范围为300～500 bp，与SSH预期插入片段的大小吻合。

2.3抑制差减文库差减效率分析经2次差减后的内参Tub基因，在经过28个循环后，隐约可见扩增条带，比未差减对照（经23个循环出现清晰的目的条带）出现扩增条带的时间晚，说明了经过2次抑制PCR后只保留了试验方受溃疡病菌侵染后，诱导表达的基因，试验方和参照方中共同转录的基因得到了有效扣除（图4）。

2.5目标基因表达模式的Realtime PCR分析从构建的文库中选取7个基因（蛋白），利用实时定量PCR分析其在6个时间点（12、24、48、72、96 和144 h）的表达情况。从图5可以看出，CXY1446、CXY0504、CXY1313和CXY142这4个基因在溃疡病菌菌诱导后表达趋势基本一致，即诱导12 h后表达水平升高；随着诱导时间的增长，这4个基因的表达水平也随之升高；CXY0112、CXY1804和CXY1727这3个基因的变化趋势基本相同，即在溃疡病菌菌诱导12 h 后这3个基因的表达水平都下降；诱导24 h 后随着诱导时间的增加，基因表达量逐渐升高，其中CXY0112基因的表达水平增加了90倍。

3 讨论

抑制差减杂交技术是从基因组水平研究差异表达基因的重要方法之一，已经成功应用于多种植物中[10-13]。笔者通过抑制差减杂交技术分析了溃疡病菌诱导毛白杨后基因的表达情况，从中获得了一些可能参与防御的候选基因。

在生物体的多种代谢反应中，苯丙烷代谢与抗病反应有着紧密关系，而细胞色素P450恰恰是这个途径的关键酶。该研究P450（CXY1804）表达水平先升后降，诱导24 h后表达水平持续稳定增长，表明在这个诱导过程中毛白杨接收了胁迫信号，对抗溃疡病基因进行调控。P450可以通过催化合成与抗病相关的次生代谢物[14]（如木质素和植保素），进而产生与病原菌诱导和抗溃疡病相关的基因或物质。与病程相关的另一个重要的蛋白-几丁质酶与植物抗病原微生物有关[15]。几丁质酶能够毁坏病原真菌细胞壁新沉积的物质，以至病原真菌死亡，并刺激了寄主的抗病反应，使寄主做出相应的防卫反应。该研究中CXY0415属于此类蛋白。几丁质酶还可以与β1，3葡聚糖酶协同作用，激发植物多种抗病反应，诱导抗病防卫反应的产生[16]。该研究中CXY1313属于此类，其表达水平一直处于上升趋势，说明当溃疡病菌侵染毛白杨树皮时，β1，3葡聚糖酶与几丁质酶这2种酶共同作用，发挥了对病原菌的抵抗，抑制了病原菌的生长。

肌动蛋白（Actin）是真核生物中一种重要的蛋白质，大量积累在附着胞形成处，可以阻止病原菌侵入[17-18]。该研究中肌动蛋白因子7 （ADF7）（CXY0112）在初始阶段表达水平很低，诱导48 h后表达逐渐增加，144 h达到最高，是初始90倍，大量积累，以更好地抵制病原菌侵入。锌指蛋白（CXY1421）属于细胞信号传递基因，可以将溃疡病菌的诱导信号传递给寄主毛白杨[19]；钙信使（CXY0504）除了传递信号外，还参与并调节基因表达，增强Active oxygen的产生，更加有效抵抗外来病菌的入侵[20-21]。锌指蛋白和Ca2+作为抗病反应信号，在生物体内是相辅相成、相互作用的，互相接受和传递信号。胡豆合酶（CXY0511）是吲哚生物碱合成途径中注：a.CXY1313；b.CXY1446；c.CXY0504；d.CXY1804；e.CXY1421；f.CXY1727；g.CXY0112。

图5实时荧光定量RT-PCR 结果重要的中间产物，也参与植物的防御反应[22]。

植物蛋白酶抑制剂[23-24]已在西红柿、农作物大豆及栗属植物中被发现，且防御功能广泛存在。在毛白杨被溃疡病菌诱导后，半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CXY1727）的表达持续升高，主要是抑制叶片中衰老基因的表达，间接延长了寄主毛白杨的寿命，抑制了病原菌的生长繁殖，反映了蛋白抑制剂在植物防御反应中的功能；笔者还发现Kunitz TI3（CXY1446）抑制剂，在锈菌侵染颤杨和杂交杨中寄主表现出对锈菌的抗性[25-26]。随着溃疡病菌侵入时间的增长，此抑制剂的表达量也迅速增加。

综上所述，抑制差减杂交技术是一种高通量检测基因差异表达的方法。该研究获得了一些防御的候选基因，为今后研究杨树与溃疡病抗性提供分子依据，为揭示此类病害发生的机理和病菌的侵染机制具有重要的意义。

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