双抗体夹心ELISA在转基因生物检测中的应用研究

薛振华　史文清　王晓凤　云鹏

摘要随着转基因产品种类和数量的不断增加，转基因生物及其产品的安全性也越来越受到关注，各国一直以来也都高度重视转基因生物及产品的管理。作为转基因生物安全评价的第一步，转基因生物的准确检测显得格外重要。该文综述了双抗夹心ELISA方法的原理、技术要点及其在转基因植物及产品检测中的应用，并对该方法在转基因动物检测中的应用前景進行分析，为双抗夹心ELISA方法的合理利用提供依据。

关键词双抗体夹心ELISA；转基因生物；转基因；检测

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03476-01

基金项目北京市农业局科技新星计划项目（20120309）；现代农业产业技术体系北京市生猪创新团队建设项目。

作者简介薛振华（1983- ），男，山东梁山人，畜牧师，从事畜禽繁殖生物技术研究。*通讯作者，从事生物技术研究。

收稿日期20131227转基因产品的检测与管理是世界性重大科技问题之一，同时也是一个关乎政治、经济、贸易等多重领域的敏感问题。自1994年美国实现了转基因番茄的首次商业化之后，转基因生物技术如今已被广泛应用于现代农业[1]。目前，在全球范围内，已有29个国家种植了转基因作物，被批准商业化的转基因生物超过100种，种植面积达到16 000万hm2[2]。很多国家将已批准的部分转基因作物作为食品或饲料的生产原料，与此同时，转基因产品的安全性受到了广泛关注[3]。迄今关于转基因产品的安全性问题仍有争论，因此需要建立转基因产品的检测技术平台，多方位、长期、系统的监测和评价其安全性。

转基因生物检测主要包括基因水平检测和蛋白质水平检测，也包括化学组织检测、生物测定检测和免疫荧光检测等。其中转基因生物基因水平检测包括定性PCR 检测[4]、定量PCR检测、RTPCR检测、Southern blot检测、Northern分析法和基因芯片检测等。转基因生物蛋白质水平检测包括Western blot检测、ELISA检测[5]、试纸条检测[6]、双向电泳检测和蛋白芯片检测等。双抗体夹心ELISA检测方法具有准确性和灵敏度高、适用范围广和检测速度快的优点。笔者着重介绍该方法在转基因植物检测中的应用，以期为转基因动物及其产品的检测提供参考。

1双抗体夹心ELISA检测方法的原理和基本步骤

ELISA检测方法分为直接ELISA检测方法、间接ELISA检测方法、双抗体夹心ELISA检测方法和竞争ELISA检测方法等；其中双抗体夹心ELISA法是检测抗原最常用的方法。双抗体夹心ELISA包括直接夹心ELISA方法和间接夹心ELISA方法。直接夹心ELISA的基本步骤是将特异性抗体包被固相载体，形成固相抗体，又称捕获抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质；加待检测样本，使之与固相抗体接触反应一段时间（37 ℃或室温反应1 h），让样本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原抗体免疫复合物；洗涤除去其他未结合的物质，加入酶标特异性抗体，即检测抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标记抗体结合，彻底洗除未结合的酶标记抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正比；加入显色底物，免疫复合物中的酶催化底物形成有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的判断。

2双抗体夹心ELISA检测方法的技术要点

在ELISA实施过程中，包被于固相载体表面的抗体的来源和制备方法对试验结果都有影响，抗体的质量是试验成功与否的关键因素。ELISA方法要求捕获抗体效价高、亲和力强。用于ELISA的抗体有多克隆抗体和单克隆抗体，抗血清成分复杂，应从中提取IgG才可用于包被固相载体；含单克隆抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高，有时可适当稀释后直接进行包被。直接夹心ELISA方法，检测抗体是酶标记的特异性抗体，酶标记的抗体也称为结合物。制备抗体酶结合物的方法通常有戊二醛法和过碘酸盐法，用于制备酶结合物用的抗体要求有较高的纯度。间接夹心ELISA法，不需要对检测抗体进行酶标记，只需购买商品化二抗结合检测抗体即可。夹心ELISA反应条件的选择，包括捕获抗体包被浓度的选择、酶标记物稀释浓度的选择、作用时间及其他影响方法灵敏度的条件的选择[7-8]。

3双抗体夹心ELISA方法在转基因植物及产品检测中的应用

ELISA技术以其高灵敏度、高特异性的特点被广泛应用于转基因植物及其产品的检测，是1对针对转基因植物中外源基因的表达产物来进行检测的技术方法。常见的外源蛋白检测方法为双抗体夹心ELISA检测方法。