玉米和拟南芥的原生质体制备及瞬时表达体系的研究

赵苏州　卢运明　张占路　赵杨敏　王磊

摘要[目的]优化玉米和拟南芥原生质体的制备条件及瞬时表达体系。[方法]以不同时期玉米叶片和拟南芥为材料分离原生质体，通过对不同酶浓度，解离时间和渗透压的研究，优化最佳分离原生质体体系；原生质体再经PEG介导的转化，通过GFP基因表达百分比鉴定原生质体活性和转化效率。[结果]玉米和拟南芥原生质分离的最佳条件为：纤维素酶1.5%， 离析酶0.5%；拟南芥酶解4 h，甘露醇浓度0.4 mol/L；玉米酶解6 h，甘露醇浓度0.45～0.50 mol/L。最佳生长时期为：拟南芥6～8片叶；玉米二片叶。用去内毒素质粒经PEG（玉米30% PEG，拟南芥40% PEG）诱导转化置于黑暗下培养，原生质体活性和转化效率较高，原生质体中可以观察到明显的GFP荧光。[结论]玉米和拟南芥原生质体的制备受酶浓度，解离时间和渗透压的影响，在原生质体转化过程中，质粒DNA纯度，PEG浓度等是影响转化效率的关键因素，与拟南芥原生质体相比玉米原生质体要稳定性差一些。

关键词玉米；原生质体； 拟南芥

中图分类号S513；Q819文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03479-04

基金项目国家转基因生物新品种培育重大专项（2011ZX08003-002）。

作者简介赵苏州（1988-），男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：植物转录因子。*通讯作者，研究员，博士，从事植物基因沉默研究。

植物原生质体是指植物细胞通过机械或酶解等特殊方法脱去细胞壁后，留下的裸露、具有生活力、被细胞膜所包围的原生质团。原生质体由于没有细胞壁，可相对容易摄取外源DNA、质粒、病毒颗粒等外源遗传物质，是進行遗传转化的理想受体；同时，原生质体也是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料；还可通过诱导形成杂种细胞，为创造新杂种开辟了途径。酶解法作为现在最常用的的方法，通过纤维素酶和离析酶将植物细胞裂解为均一的单细胞体系，能获得完整和高活性的原生质体[1-2]。纯化后植物原生质体可按既定方向进行培养，使原生质体适合于遗传转化、细胞融合、生理研究、体胚发生、器官发生等操作[3]。因此，原生质体的制备是其中最关键的一部，如何获得完整且活性较高的原生质体是各项工作的起始。在植物快速繁殖、植物远缘遗传重组、转基因以及品种改良和创造新类型等方面具有广阔的应用前景。

原生质体作为常用的植物瞬时表达系统，植物中瞬时表达系统具有检测速度快、转化简单等特点，结合报告基因RFP、YFP、GUS[4]、GFP[5]、EGFP[6]等的使用，该技术被广泛地用于基因功能分析的研究，如基因表达、蛋白亚细胞定位、染色质免疫沉淀、蛋白活性检测以及蛋白间互作等[7]。原生质体瞬时表达系统相继建立，为研究蛋白的亚细胞定位和基因的表达调控提供了方便而有效的试验系统。玉米和拟南芥原生质体转化体系可以对研究基因的功能和调控途径的研究具有重要意义。笔者用玉米和拟南芥相互对照分离和纯化，以期获得高产接高活力的原生质体，再通过PEG介导转化的方法，成功建立玉米和拟南芥叶肉原生质体较高效的瞬时表达系统。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。选取玉米（Zea mays L.）自交系宗31饱满的种子，用10%过氧化氢消毒，用灭菌水冲洗3次置于发芽机，生长5 d，待胚芽长至约2 cm，移置营养土中，置于温室培养1周左右，长至2叶期和3叶期，选取第2片伸展的叶子作为提取玉米原生质体的材料。

1.1.2 主要试剂。氯化钠、氯化镁、氯化钙、甘露醇、葡萄糖、MES、PEG 4000，购自Sigma公司；Cellulase R10和Macerozyme R10，均购自Japan Yakult Honsha， Tokyo；金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒（Lot：00071309），购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原生质体的制备。拟南芥先用无水乙醇洗5 min，然后再用75%的乙醇加0.1%Triton100洗3 min，分别用95%乙醇再洗1遍，晾干后播种与1/2MS中，在温度22 ℃/18 ℃光照14/10 h周期下7 d左右，移栽至营养土中，分别取到8～10片叶和12～14片叶期的拟南芥，取拟南芥叶片作为原生质体。

1.2.2 质粒提取。pCAMBIA1303表达框由花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、GFP报告基因、胭脂碱合成酶终止子（NOS）构成。按照说明书用康为世纪无内毒素质粒大提试剂盒抽提质粒，-20 ℃保存备用。

1.2.3 酶解液配置。取0.5%～2.0%纤维素酶R10，05%～1.5%离析酶R10，0.3～0.6 mmol/L D甘露醇，20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES（pH 5.7）混合液置于55 ℃水浴10 min，冷却至室温后，加入10 mmol/L CaCl2，0.1% BSA，并用0.45 μm滤膜过滤到培养皿中。

1.2.4 原生质体制备和产量的测定。将玉米叶片和拟南芥叶片去两端切成约0.5～1.0 mm细丝，把切好的叶片放入含有酶解液，室温黑暗中振荡（转速为40 r/min）酶解（2～7 h）。显微镜下检查溶液中的原生质体，玉米叶肉原生质体大小大约30～40 μm，拟南芥叶肉原生质体大小大约30～50 μm。在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5[2 mmol/L MES（pH 5.7），154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl]溶液稀释含有原生质体的酶液。先用W5溶液润湿35～75 μm的尼龙膜或60～100目筛子，然后用其过滤含有原生质体的酶解液。将过滤后的绿色混合物置于40 ml圆底离心管中，400 r/min，2 min。洗涤沉淀1次，离心后弃上清液，再次加入W5，重悬沉淀，置于冰上30 min。再次400 r/min离心2 min，弃上清液，加入适量的MMg溶液（4 mmol/L MES，0.4 mmol/L D甘露醇，15 mmol/L MgCl2），备用。参考侯岁稳的原生质体简易计数方法[8]。

1.2.5 PEG介導原生质体转化和激光共聚焦显微镜检测。吸取10 μg质粒于2 ml圆底离心管中，加入制备好的100 μl原生质体溶液混匀，原生质体加入等体积30%～50% PEG-Ca2+溶液[PEG4000（m/v），200 mmol/L甘露醇，100 mmol/L CaCl2]，将混合物用2倍体积的W5溶液清洗2次，最后加入500 μl W5溶液置于室温、弱光下培养15 h。转化GFP融合载体的原生质体培养过夜后用Leica激光共聚焦显微镜SP5观测荧光分布[9-10]。

2结果与分析

2.1酶液浓度对原生质体分离的影响 在含不同浓度组合的酶解液中黑暗裂解（拟南芥4 h，玉米6 h），其原生质体的分离情况见表1。由表1可知，随着酶浓度的不断增加，玉米和拟南芥叶肉原生质体的产量逐渐提高。当2种酶的浓度达到1.5%和0.5%以上后，原生质体的产量增加不明显。拟南芥中当两种酶的浓度均达到1.5%以上后，原生质体的产量逐渐减少，碎片也较多。玉米中情况稍微有点差别，在2种酶浓度均达到1.5%或2.0%，1.0%以上后，原生质体产量逐渐减少，碎片也较多。因此，从原生质体的产量、细胞碎片的多少及酶的使用量等多方面综合考虑，拟南芥叶肉原生质体分离的最佳的酶类组合为纤维素酶1.5%，离析酶0.5%，玉米原生质体则有2个选择，1个和拟南芥相同，产量较多，碎片少，另外纤维素酶2%，离析酶0.5%，产量最多，碎片稍微增多。

2.2酶解时间对原生质体分离的影响 试验比较了酶解2、3、4、5和6 h对拟南芥和玉米叶肉原生质体分离效果的影响，结果见表2。结果表明，随着酶解时间的增加，原生质体产量不断提高，酶解4 h时，拟南芥原生质体产量最高，达（7.0±1.2）×105/ml，玉米则继续增加，在6 h使玉米产量最高，达（6.0±2.1）×105/ml。当达到最大产量后，叶肉细胞已趋于完全解离，酶液中叶片成透明状。酶解时间继续增加，原生质体产量反而下降。究其原因可能是由于长时间的酶解使一部分已解离的原生质受到损伤进而解体的缘故。

2.4PEG浓度对原生质体转化的影响 PEG4000（聚乙二醇4000）分子能改变各类细胞的生物膜结构，使2细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，原生质体体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，降低细胞表面的极性，促使之间粘着和结合，在高pH、高钙离子的作用下，钙离子和结合在质膜上的PEG被洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使2种原生质体形成具有共同质膜的融合体。由表4可知，试验选用PEG4000对拟南芥叶肉原生质休进行转化，结果发现在PEG4000浓度发生变化时，转化效率也随之发生变化。PEG浓度为20%时，拟南芥转化效率仅有9%，随着PEG浓度的升高转化效率也随之升高；当PEG浓度为40%时，转化效率达到67%（图1A）。玉米中在PEG浓度20%时转化效率有17%，在30%和35%时转化效率达到了45%左右（图1B），且细胞碎片较少，PEG浓度在增加虽增加了转化效率，但是细胞碎片开始增多。PEG的浓度越高，其对细胞的影响也越来越大，因为PEG对细胞有一定的毒害作用，高浓度下常致使细胞发生破碎。另外，PEG的物理化学性质决定了其在较高浓度下（大于或等于50%）很难溶解，所以在较高浓度下不便于试验操作。所以在转化拟南芥和玉米原生质体时，试验选择了40%和30%的溶液，以达到最好的效果。在培养16 h后用激光共聚焦显微镜观察，发现拟南芥转化效率（67%）比玉米转化效率（45%）高，细胞碎片比玉米少。

3结论与讨论

酶解去壁对植物细胞是一个严重的机械损伤和生理损伤过程[11]。原生质体适宜的分离条件要求既能将细胞壁完全去除，又要尽量减少对原生质体的损伤。采用酶解法来游离烟草叶肉原生质体时，试验发现酶液的浓度、酶液的处理时间及其渗透压等对原生质体的产量及转化活力等都有很大的影响。日本生产的纤维素酶（ Cellulase R10）和离析酶（M acerozyme R10）效果最佳，酶浓度经过组合分析，发现拟南芥在1.5% Cellulase R10，0.5% Mecerozyme R10时裂解比较完全并且细胞碎片比较少，玉米在1.5% Cellulase R10，0.5% Mecerozyme R10时裂解也比较完全。在据以往的报道，渗透压稳定剂一般是用甘露醇、山梨醇、蔗糖或葡萄糖等，试验过程中用甘露醇渗透压稳定剂， 结果是在拟南芥当甘露醇浓度为0.40 mol/L时原生质体游离效果最为理想，玉米以浓度为0.45～0.50 mol/L的甘露醇做酶液的渗透压稳定剂时效果最理想。酶解处理一般静置在黑暗中进行，拟南芥和玉米在未去表皮情况下酶解时间分别以4和6 h最佳，如果超过时间，原生质体的转化活力就会明显降低，细胞碎片增多。

在质粒转化过程，PEG浓度对转化效率和转化后的原生质体状态有很大的影响，拟南芥在40%或者45%浓度下可以获得较高的转化效率，玉米在30%可以获得较高的转化效率和保持稳定的原生质体。玉米原生质体比拟南芥原生质体容易皱缩破裂，玉米一般在16 h后就开始破裂，而拟南芥在4 ℃却可以保持48 h以上还可以看到GFP。还有材料状态、质粒纯度和培养过程，都会对转化效率有很大影响。尤其是在双质粒转化过程，需要较高的转化效率，最后是用氯化铯超速离心法提取超纯质粒。酶解后的原生质体失去了细胞壁的保护，极易受渗透压变化的影响而导致破裂，因此在制备原生质体的过程中，要保证酶解液等所用溶液的渗透压尽量接近在玉米叶肉细胞自身的渗透势，避免细胞吸水胀破或者失水皱缩；所有的操作过程都要轻柔，尤其是用移液枪吸取和离心速度要控制好，以防止因剧烈震荡而导致原生质体破裂；在原生质体转化过程中，PEGCa2+浓度（玉米30%和拟南芥40%）、质粒DNA纯度，PEG诱导转化时间等是影响转化效率的关键因素。

参考文献

[1] FROOZABADY E.Rapid plant regeneration from Nicotiana mesophyll protoplasts[J].Plant Sci，1986，46：127-131.

[2] SAXENA P K，GILL R.Plant regeneration from mesophyll protoplasts of the tree legume Pithecellobium dulce benth[J].Plant Sci，1987，53：257-262.

[3] CHU C C.Contributions of Chinese Botanists to Plant Tissue Culture in the 20 Cen tury[J].Acta Botanica Sinica，2002，44（9）：1075-1084.

[4] JEFFERSON R A，BURGESS S M，HIRSH D.betaGlucuronidase from Escherichia coli as a genefusion marker[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1986，83（22）：8447-8451.