林木体细胞胚胎发生影响因子研究进展

曾超 代金玲 白玉娥 呼都特

摘要 林木的体细胞胚胎发生是体细胞在人工无菌培养条件下分化产生体细胞胚胎的过程，该技术作为现代生物技术的重要组成部分，不仅在遗传改良和快速繁殖等方面有着重大意义，也展现出了在实际生产中良好的应用前景和发展趋势。文章综述了体细胞胚胎发生的几个重要影响因子——材料、培养基、生长调节剂以及培养条件，提出了今后在林木体细胞胚胎发生研究方面应加强对幼胚的进一步分类、胚性愈伤的区分、控制体细胞胚胎发生的同步化等问题的研究。

关键词 体细胞胚胎发生；影响因子；林木

中图分类号 S722.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-05100-04

林木的体细胞胚胎发生是体细胞在人工无菌培养条件下分化产生体细胞胚胎的过程。它的相关研究起源于20世纪70年代后期。Rao等[1]首次报道檀香（Santalum album Linn.）的体细胞胚胎发生研究。40多年来，全世界已对50余科180余种木本植物成功地进行了体细胞胚胎发生诱导并培育出再生植株，其中木本被子植物46科95属140余种，木本裸子植物7科16属的50余个树种[2]。我国从事林木体细胞胚胎发生和植株再生的技术研究起步较晚，目前涉及的树种有松属（Pinus）[3]、杨属（Populus）[4]、云杉属（Picea）[5]、文冠果属（Xanthoceras）[6]、葡萄属（Vitis）[7]、橡胶树属（Hevea）[8]等数10个树种。

体细胞胚胎发生有2种途径：直接体细胞胚胎发生，由外植体直接发育成体细胞胚；间接体细胞胚胎发生，由外植体脱分化形成愈伤组织，然后愈伤组织再分化产生体胚。大多数林木树种都可以通过第1种途径产生体细胞胚，其中多以被子植物为主。而针叶树所属的裸子植物体胚发生较难，一般需采用第2种方式产生体细胞胚。体细胞胚的直接发生一般比间接发生遗传稳定。周丽侬[9]等在园艺植物体胚发生和植株再生的研究中得出，外植体和培养条件都会对植物的体胚发生造成影响。植物体细胞胚胎发生受到多种内因和外因的影响，外植体自身个体的发育阶段和生理状态对林木组织培养成功与否起关键作用，而外植体的生长和发育方向由培养基和生长调节剂的种类、浓度决定[10]。只有合理地调节内因和外因的作用，才能获得大量高质量的林木体胚。

1 材料

1.1 基因型 基因型是影响林木体细胞胚发生的主要内因。即使选用大小一致的外植体和相同培養条件来诱导塞尔维亚云杉的5个品种植物体胚，其体胚诱导率也各不相同，最高可达18.7%，最低却只有1.3%[2]。不同基因型的体细胞胚诱导频率差别很大，其原因可能是不同基因型的最适诱导培养条件存在着较大的差异。姚娜[11]对10个表现优良的毛白杨基因型进行离体培养，发现不同毛白杨基因型无论是最佳外植体消毒方法、培养基种类，还是生长调节剂种类和浓度均存在差异。

1.2 外植体 体胚发生中外植体的筛选是成功的前提。任何细胞均具有全能性，理论上讲，植物体的各类器官，如根、茎、叶、花、种子都可以产生体胚。然而体胚发生要获得成功不仅依赖于外植体的来源和选择部位，也跟外植体的生长发育、生理状态有很大关系。Merkle[12]的研究表明，林木的体胚发生只能选取种子或幼苗进行诱导，合子胚或种子的不同发育时期对诱导体胚的影响很大。分化程度较低的组织是利于体胚诱导的最佳外植体[13]。未成熟合子胚因其细胞全能性高、脱分化容易，在诱导体细胞胚发生时具有显著优势[14]。

此外，茎尖、叶片也可以作为诱导体胚的外植体。由于叶和茎中的细胞处于一个非常复杂的分化时期[15]，所以只能用于山杏[16]、悬铃木[17]之类体胚发生较为容易的阔叶树种。

2 培养基

外植体经采集，置冰箱中冷藏（4 ℃）备用。试验前用水洗净，浸泡一定时间后，用乙醇、次氯酸等试剂灭菌处理后接入培养基。不同种类植物的体细胞胚胎发生一般需要选择不同的培养基。植物组织培养中常用的基本培养基主要有MS、LM、SH、N6、WPM、DCR、LP等。

2.1 MS培养基 MS培养基是目前使用最为广泛的培养基。和其他培养基相比，MS培养基中硝酸盐、钾和铵的含量较高。陈金慧[18]等在对杂交鹅掌楸的体胚研究中发现，以MS为基本培养基，对体胚的诱导最为有效。习洋等[19]也成功以刺槐成熟合子胚为外植体，用MS培养基诱导出体胚。陈夜江[20]认为，在果树体胚的诱导中，常选用MS培养基，因为MS培养基含有较高水平的NH4NO3，对果树的体胚发生有促进作用。

2.2 DCR培养基 针叶树植物体胚诱导需要低浓度NO3-和NH4+，所以含有较低浓度NO3-和NH4+的DCR培养基在针叶树的组培中应用最多[21]。相同激素条件下，DCR培养基对落叶松体胚的诱导效果明显好于MS培养基[22]。DCR培养基大量元素含量较少，适合松科植物。李茜等[23]研究表明，将白皮松成熟合子胚接种于DCR培养基上，愈伤生长迅速，具有较强的分化能力。李清清[24]采用DCR诱导分化黑松未成熟合子胚，成功建立了黑松的体细胞胚胎发生体系。

2.3 其他培养基 培养基种类繁多，不同植物、不同阶段所选用的培养基各不相同。MS培养基在云杉属树种体细胞胚胎的诱导中起阻碍作用，一般常用LP培养基。相比其他培养基，LP培养基钙盐含量较高，可以加速植物体内代谢，促进生长。湿地松体细胞胚胎发生在使用DCR培养基时的植株再生率只有10%[25]，而使用了LP培养基培养的湿地松植株再生率显著提高（25.2%）[26]。北美云杉和红云杉体细胞胚胎诱导的最适培养基是1/2LM。SH培养基中的有机成分含量明显高于LM培养基5倍以上，在沙地云杉体胚研究中有很好的应用[27]。WPM培养基在阔叶乔木的初代培养当中效果较好。B5培养基是文冠果非胚性愈伤组织诱导的最佳培养基，在弱光中悬浮培养容易形成体细胞胚[28]。根据植物生长所需营养物质的不同合理选择培养基，是体细胞胚胎发生的重要环节。

3 生长调节剂

培养基中附加外源激素和有机物的种类、浓度及组合对体胚的诱导、增殖、分化以及发育都会产生较大的影响。合理地选择生长调节剂，对建立体细胞胚胎发生体系尤为重要。

3.1 外源激素

3.1.1 生长素。体胚发生常用的生长素有2，4.D和NAA。大多数林木必需在含有2，4.D的培养基下才能诱导体胚发生。2，4.D可以起到调节和平衡内源生长素的作用[28]，在已诱导出体胚的植物中，大约有65%单独或与其他激素搭配使用了2，4.D[29]。然而2，4.D的浓度过高对体胚分化有着不利影响。愈伤组织在含有2，4.D的培养基上长时间培养，容易造成体胚成熟能力的减弱或丧失。一般采取降低浓度继代或者用作用较弱的NAA替换的方式，这样有利于体胚的分化和发育。特别是在增殖培养阶段，用NAA代替2，4.D更有利于体细胞胚的发生[30]。席梦利等[31]研究表明，DCR +6.BA 1.0 mg/L+TDZ 0.003 mg/L+NAA 0.1 mg/L是杉木成熟合子胚诱导体胚的最佳培养基[31]。

3.1.2 细胞分裂素。细胞分裂素同样是影响体胚发生与植株再生的重要因子。对于大多数林木来说，只用生长素很难诱导出体胚，只有将细胞分裂素与生长素合理搭配使用才能有效提高体细胞胚胎发生概率[10]。一般体胚研究常用的细胞分裂素有6.BA、KT和ZT。吕秀立等[32]的研究表明，诱导欧洲七叶树愈伤组织的最佳培养基是MS+2，4.D 2 mg/L+KT 0.2 mg/L，MS+6.BA 8 mg/L+NAA 1 mg/L有利于胚性愈伤的诱导和增殖，添加ZT 2 mg/L或6.BA 5 mg/L和NAA 0.2 mg/L的MS培养基有利于体胚发育和成熟。

3.1.3 脱落酸（ABA）。脱落酸（ABA）在体胚的成熟和萌发方面有重要的影响[10]。以花旗松为例，Taber等[33]在体细胞胚发育的刺激阶段和成熟阶段均使用了ABA。ABA在植物体细胞胚成熟过程中有着重要的作用[34]。主要表现在以下方面：促进体胚分化，提高正常体胚发生频率；抑制早熟体胚的发生，降低不正常体胚的发生频率；提高体胚分化的同步化程度[35]。目前，已经成功利用ABA分化出白杄、欧洲落叶松、华北落叶松、湿地松等林木体细胞胚。不同植物种类对ABA浓度的反应不同，0.12～0.15 mg/L的ABA可促进橡胶胚性愈伤组织形成体胚[36]，而华北落叶松体胚的成熟培养过程中ABA浓度达到了19 mg/L[37]。单独使用ABA，有可能抑制体细胞胚发生[38]。所以进一步明确ABA的最佳作用浓度、添加时间和使用方式，可更好地使用ABA，加速林业生产。

3.1.4 TDZ。TDZ是新合成的一种杂环芳香脲，它具有很高的活性，同时拥有生长素和细胞分裂素的双重特点。TDZ对内源植物生长激素起调节作用，也可以在诱导逆境中起间接作用，它还具有调节细胞膜结构，调节能量水平等多种作用。到目前为止，TDZ已经成功促使近100种组培困难的林木获得再生植株[39]。有研究表明，TDZ与6.BA搭配使用，可以促进北美乔松成熟合子胚不定芽的发生[40]。其原因可能是6.BA和TDZ在植物细胞内识别位点和代谢途径各不相同，从而产生各异的生物学效应。席梦利[31]通过杉木的体胚发生得出结论，低浓度的TDZ与6.BA配合使用，可以實现生物学效应的互补，提高体胚的分化效率。

植物激素稳定性也是一个十分重要的问题。大多数植物激素难以保持长久，一段时间后会产生难溶沉淀，对体胚发生造成影响。比如NAA、IBA和KT等3种植物激素在其适宜条件下的保存时间分别最好不要超过40 d、20 d和40 d[41]。每种激素的保存条件都不尽相同，IBA母液必需遮光保存，KT母液必需低温并遮光保存等。

3.2 其他添加物质

3.2.1 蔗糖、氨基酸。植物体细胞胚胎发生同样会受到培养基中蔗糖浓度的高低、有机附加物的使用、渗透剂的添加等因素的影响[42]。蔗糖不仅是培养基中最重要的碳源，也对培养基的渗透势起着调控作用。氨基酸、水解酪蛋白、香蕉汁等有机附加物可为培养物提供更易代谢的还原态氮，这在体胚诱导中有特殊的作用。吕守芳等[43]对日本落叶松体胚的研究中对这一推论进行了证实，在体胚诱导、增殖、成熟的培养基中同时使用了450 mg/L谷氨酰胺和500 mg/L水解乳蛋白，体胚诱导率、体胚增殖率、体胚成熟率分别达到15.5%、165.2%、10.57个/g。

3.2.2 活性炭。在培养基中添加活性炭也可以对植物体细胞胚的形成和生长发育起促进作用。活性炭可以吸附细胞产生的代谢废物及培养基中部分激素；在体胚成熟阶段，为使胚性胚柄团进一步发育，需使用活性炭除去培养基中的2，4.D和6.BA[26]。

3.2.3 聚乙二醇。聚乙二醇（PEG）分子是一种亲水性很强的惰性高分子聚合物，它能改变各类细胞的生物膜结构，在适当的浓度下，可以通过胁迫作用降低体细胞胚中的含水量，有效地调控体细胞胚的成熟。唐巍等[26]通过在LP培养基上附加4 mg/L ABA，75 g/L PEG和5 g/L活性炭，使湿地松的早期原胚发育形成了粗壮的子叶胚。

3.2.4 部分离子。部分离子对体细胞胚胎发生也会产生影响。以枸杞为例，枸杞的愈伤诱导在加入50 mg/L的AgNO3的培养基上体胚发生率是不加AgNO3的3倍左右。超过此浓度后，Ag+反而会抑制枸杞的体细胞胚发生[44]。

4 培养条件

植物体细胞胚胎发生的基本培养方式有3种：固体培养、液体培养、固-液结合培养。不同的培养方式在体胚发生中所起的作用都各不相同。体细胞胚在固体培养基上的生长效率和产出质量都较高，而液体培养可以改善培养物的供氧情况，提高体细胞胚产量，易于体细胞胚的分离、筛选和收集[45]。

将外植体接入培养基后，需放置在适宜的条件下进行培养。定时继代对于整个胚胎发育过程都很重要。固体培养继代周期为2～3周，液体培养则最多每隔7 d换液1次[46]。光照、温度等培养条件对诱导林木体胚发生和植株再生起着重要调控作用。组织培养一般选择光培养，而胚性愈伤的诱导、增殖和分化大多采用暗培养[47]，温度22～25 ℃。Gupta等[48]发现，培养光照条件很大程度上与所选用的培养基相关。挪威云杉成熟胚利用改良1/2MS培养基在24 h光培养下同样可以诱导出白色半透明的胚性愈伤，然而，多次继代后，胚性愈伤容易褐化并局部变绿，这对体胚的后期形成不利[49]。值得注意的是22～27 ℃是胚性愈伤组织最佳的诱导、生长、分化的温度，当超过30 ℃时，胚性愈伤组织将会永久丧失体胚发生能力。此外，不同阶段植物对光照的需求差异很大，苹果叶片暗培养更有利于促进不定梢再生[50]，而长时间光照不足易引起再生苗玻璃化[51]。可见，不同林木体细胞胚发生对于光照、温度的要求各不相同，不能一概而论，需要逐一进行探索。

5 问题与展望

林木的繁殖方法包括枝条扦插、不定芽的形成和体细胞胚胎发生3种[52]。体细胞胚胎发生途径以高繁殖效率和高同步化水平优于传统的种子繁殖和其他的无性繁殖。该领域研究主要在林木的优良基因型快速繁殖、基因转化、种质保存及突变体筛选等方面呈现出巨大的应用潜力[53]。我国的林木体细胞胚胎发生研究起步较晚，虽然已经取得了一定的进展，但仍有很多问题需要进一步探讨。

5.1 幼胚的进一步分类 众多研究表明幼胚是林木体细胞胚胎发生的最佳外植体。然而幼胚发育成成熟胚的时间较长，采种期从1～3个月不等。靳小翠[54]每隔10 d左右采种1次，探讨了不同的采种期对马尾松胚性愈伤组织诱导的影响。DRAGANA STOJICˇIC'更是提出，体胚产生与否只跟外植体的发育阶段有关，培养条件只影响体胚发生的诱导率[55]。因此，对幼胚各个阶段进一步分类，尤为必要。

5.2 胚性愈伤的区分 现如今常规的区分胚性愈伤方法是通过制作石蜡切片，根据体胚细胞学特性所表现出的4个时期—球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚使用显微镜进行观察。然而就体胚形态学上的特征众说纷纭，普遍认知为愈伤呈白色丝状。具体过程为[56]：非胚性愈伤组织的边缘出现外起源的原胚突起，原胚横径方向迅速生长，胚体发育成灰白色球形，随时间胚体增大增长，基部产生明显的下胚轴，中上部也长出明显的子叶原基，最终形成具备完整结构的成熟胚。

5.3 控制体细胞胚胎发生的同步化 一方面要真正实现体细胞胚的工厂化和自动化生产，满足优良品系扩繁及大面积造林的需求，为林业生产应用开辟一条行之有效的途径，需要实现体细胞胚胎发生的同步化[57]。另一方面人工种子的制作也要求胚状体形态大小一致，发育进程相似，即体胚同步，这样制成的人工种子活力强，萌发率高[58]。体胚的同步化受到渗透压、低温、激素浓度等多个因素影响，目前只在栓皮栎[59]、水曲柳[57]、荔枝[60]、龙眼[61]等少数几种林木中进行过细胞同步化培养及体细胞胚发生同步控制的研究。

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